【摘要】：背景： 由于角膜新生血管(Corneal Neo vascularization, CNV)尚無有效的治療方法,至今仍是致盲的主要原因之一,探討如何有效地抑制角膜新生血管的發(fā)生和發(fā)展,現(xiàn)已成為角膜病研究中的熱點(diǎn)。目前對(duì)于角膜新生血管的發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚,進(jìn)一步探索角膜新生血管的發(fā)病機(jī)制及其有效治的治療方法具有重要的理論和臨床意義。Survivin是凋亡抑制蛋白家族中的一個(gè)重要成員,具有強(qiáng)大的抗細(xì)胞凋亡作用,并在維持細(xì)胞有絲分裂和血管形成過程中扮演重要角色。研究提示,survivin在多種人類腫瘤的新生血管中具有重要的作用,其是否與角膜新生血管發(fā)生有密切的關(guān)系并不清楚。 目的： 本研究旨在通過建立大鼠角膜新生血管模型,研究凋亡抑制蛋白survivin是否與角膜新生血管的形成相關(guān),其特異性抑制劑YM155對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)增殖和凋亡的影響以及對(duì)角膜新生血管的作用。 方法： 1.采用1mol/L NaOH誘導(dǎo)大鼠堿燒傷角膜新生血管模型。堿燒傷后1、3、7、14天采用帶有相機(jī)的手術(shù)顯微鏡照相并測(cè)量角膜新生血管長(zhǎng)度,計(jì)算角膜新生血管面積。采用免疫組織化學(xué)染色、免疫熒光染色和Western Blot檢測(cè)堿燒傷后角膜組織中survivin的表達(dá),實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)堿燒傷后角膜組織中survivin和VEGF-A mRNA的表達(dá)。 2. HUVECs在含2%FBS和50ng/ml VEGF165的DMEM高糖培養(yǎng)液中培養(yǎng),觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況,采用免疫熒光和Western Blot檢測(cè)survivin蛋白在HUVECs中的表達(dá)。MTT法檢測(cè)不同濃度YM155(0、1.25、2.5、5、10、20、40、80、160nmol/L)作用于HUVECs不同時(shí)間(12h、24h、48h、72h)后對(duì)細(xì)胞增殖的影響。流式細(xì)胞分析法檢測(cè)0、5、20nmol/L YM155作用IUVECs48h后,對(duì)HUVECs凋亡的影響。Western Blot檢測(cè)20nmol/L YM155作用于HUVECs不同時(shí)間(12h、24h、48h、72h)后對(duì)細(xì)胞survivin蛋白表達(dá)的影響。 3.48只健康無眼疾SD大鼠,右眼堿燒傷誘導(dǎo)大鼠角膜新生血管形成,造模后隨機(jī)分為2組,分別給予lmg/ml YM155滴眼(藥物治療組)和PBS滴眼(對(duì)照組),連續(xù)點(diǎn)眼14天,每日兩次。手術(shù)顯微鏡下觀察和測(cè)量各組角膜新生血管的長(zhǎng)度和累計(jì)的鐘點(diǎn)數(shù),并計(jì)算出新生血管的面積。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western Blot檢測(cè)兩組大鼠角膜組織中survivin mRNA和survivin表達(dá)的變化。 結(jié)果： 1.大鼠角膜堿燒傷后第1天,角膜緣血管擴(kuò)張充血。堿燒傷后第3天可見角膜緣處毛刷狀新生血管芽生長(zhǎng)密集,并向角膜中央方向延伸。堿燒傷后第7天,新生血管生長(zhǎng)最旺盛,血管增多變長(zhǎng),主干粗大筆直、末端分支相交織呈網(wǎng)狀,部分血管吻合,延伸至角膜中央燒傷區(qū)。堿燒傷后第14天,新生血管生長(zhǎng)接近角膜中心,幾乎布滿整個(gè)角膜,面積達(dá)高峰,血管伸長(zhǎng)變細(xì),分支減少,部分血管開始閉鎖退化。 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,對(duì)照組大鼠角膜組織(正常大鼠角膜)中,幾乎檢測(cè)不到CD31和survivin陽性染色。堿燒傷后第7天,大鼠新生血管角膜組織基質(zhì)層內(nèi)CD31和survivin陽性染色的棕黃色顆粒明顯增多。免疫熒光結(jié)果與免疫組化結(jié)果相似,即大鼠正常角膜組織中CD31和survivin幾乎沒有陽性熒光染色,新生血管角膜組織基質(zhì)層內(nèi),CD31和survivin陽性熒光染色明顯增多,且部分染色重合。 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示,正常大鼠角膜組織中少量survivin和、EGF-A mRNA表達(dá)。堿燒傷后第1天survivin mRNA升高不明顯(P0.05),后逐漸升高,至堿燒傷后第3天、第7天和第14天大鼠角膜組織中survivin mRNA表達(dá)明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；其中第7天survivin mRNA表達(dá)最高。堿燒傷后第1天,角膜組織中VEGF-A mRNA表達(dá)較正常對(duì)照組升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05；堿燒傷后第3天、第7天和第14天大鼠角膜組織中VEGF-A mRNA表達(dá)明顯升高,差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)；其中第7天VEGF-A mRNA表達(dá)最高。堿燒傷后大鼠角膜組織中survivin和VEGF-A mRNA的表達(dá)具有顯著的相關(guān)性(r=0.980,P0.01)。Western Blot結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了堿燒傷后第3天、第7天和第14天survivin蛋白表達(dá)明顯升高,差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),其中第7天survivin蛋白表達(dá)升高至最高峰。 2.HUVECs在含2%FBS和50ng/ml VEGF165的DMEM高糖培養(yǎng)液中增殖明顯,激光共聚焦顯微鏡下見HUVECs的胞漿和胞核中有survivin紅色陽性熒光染色,且胞漿染色較胞核更顯著。Western Blot結(jié)果顯示HUVECs在此培養(yǎng)液中培養(yǎng),survivin蛋白表達(dá)逐漸增高,至12h-18h左右達(dá)高峰,24h有所降低。MTT結(jié)果顯示YM155作用HUVECs48和72h后,對(duì)細(xì)胞的體外增殖能力的抑制作用明顯。藥物濃度低至5nmol/L即可以顯著抑制HUVECs增殖。YM155對(duì)HUVECs的抑制作用具有時(shí)間劑量依賴性。由MTT結(jié)果計(jì)算出YM155作用HUVECs48h,該藥物的IC50值為8.68nmol/L;藥物作用]HUVECs72h的IC50值為5.77nmol/L.流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示5和20nmol/L YM155作用細(xì)胞48小時(shí)后,與對(duì)照組相比,HUVECs凋亡明顯增多,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。Western Blot結(jié)果顯示20nmol/L YM155作用HUVECs12h、24h、48h和72h, survivin蛋白表達(dá)明顯減少,差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。 3.堿燒傷后第7天和第14天,YM155治療組大鼠角膜新生血管面積明顯小于對(duì)照組,差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)；與對(duì)照組相比,實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示用藥后第7天,YM155治療組大鼠新生血管角膜組織中survivin mRNA表達(dá)明顯減少,差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),用藥后第14天,survivin mRNA表達(dá)仍小于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。Western Blot結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了YM155治療組大鼠角膜組織中survivin蛋白表達(dá)明顯減少,差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。 結(jié)論： 本研究首次探討了凋亡抑制蛋白survivin與角膜新生血管的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：survivin與大鼠堿燒傷角膜新生血管的形成密切相關(guān),其抑制劑YM155對(duì)HUVECs具有明顯的抑制增殖和促進(jìn)凋亡作用,并且可有效抑制大鼠堿燒傷后角膜新生血管的形成,為以survivin作為靶點(diǎn)治療角膜新生血管提供了理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
【圖文】：

華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文圖1-1.堿燒傷法誘導(dǎo)大鼠角膜新生血管。A,大鼠的正常角膜透明，無血管。B，，堿燒傷后第1天，大鼠角膜混油明顯，角膜緣血管網(wǎng)擴(kuò)張充血，但無明顯的新生血管侵入角膜。C，堿燒傷后第3天，可見毛刷樣的新生血管自角膜緣處向角膜中央方向張入。D，堿燒傷后第7天，新生血管增粗變長(zhǎng)，到達(dá)中央的堿燒傷區(qū)。E,堿燒傷后第14天，新生血管延長(zhǎng)到角膜中央?yún)^(qū)，兒乎覆蓋整個(gè)角膜。表1-2.堿燒傷后不同時(shí)期角膜新生血管面積Id 3d 7d 14d面積（_2) 1.33±0.57 13.61±2.23 30.94±1.72 37.27±0.60

圖1-3.大鼠角膜HE染色圖片。A，正常大鼠角膜HE染色，可見角膜組織結(jié)構(gòu)清晰，基質(zhì)層由規(guī)則排列的膠原纖維板及散在均6J分布的角膜細(xì)胞構(gòu)成；堿燒傷后第7天，新生血管角膜基質(zhì)層明顯增厚，基質(zhì)層內(nèi)可見大量的血管內(nèi)皮細(xì)胞以及充盈有紅細(xì)胞的血管腔。Bai=20pm。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R772.2

【參考文獻(xiàn)】

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1 曾靜;羅殿中;黃明漢;鄧妮妮;黨裔武;;血管抑素對(duì)角膜新生血管和VEGF表達(dá)的作用[J];國際眼科雜志;2010年06期

2 曾靜;羅殿中;黃明漢;王國華;;血管抑素對(duì)角膜新生血管及白介素-1α表達(dá)的作用[J];廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2010年03期

3 Ebru Eren Akar;Veysi 銉ner;Cem Kü

本文編號(hào)：2533319