本文關(guān)鍵詞：熊果酸滴眼液抑制縫線誘導(dǎo)大鼠角膜新生血管的實(shí)驗(yàn)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《南方醫(yī)科大學(xué)》 2014年

熊果酸滴眼液抑制縫線誘導(dǎo)大鼠角膜新生血管的實(shí)驗(yàn)研究

曾麗娜  

【摘要】：[研究背景] 正常角膜在多種因素共同作用下處于穩(wěn)定的“免疫赦免”狀態(tài),以保持角膜的透明性,使角膜能夠發(fā)揮正常的生理功能。在某些因素作用下,如配戴角膜接觸鏡、感染、眼外傷、熱燒傷或化學(xué)傷、既往手術(shù)史、免疫性眼病等可使角膜的“免疫赦免”平衡被打破導(dǎo)致角膜新生血管(corneal neovascularization,CNV)的產(chǎn)生。雖然角膜新生血管對清除感染、促進(jìn)傷口愈合、抑制角膜溶解等有一定作用,但角膜新生血管可破壞角膜正常微環(huán)境,使眼前節(jié)相關(guān)免疫赦免偏離消失,使角膜失去透明性,嚴(yán)重影響視力甚至導(dǎo)致失明。角膜新生血管的發(fā)病機(jī)制尚不明確,目前研究發(fā)現(xiàn)新生血管的發(fā)生與促血管生成因子及抗血管生成因子的失衡、角膜緣血管屏障破壞、缺氧、炎癥反應(yīng)、角膜水腫等多種因素的參與有關(guān)。 目前對于角膜新生血管的治療原則主要有抑制血管生成和促進(jìn)血管退化,具體有：藥物治療如激素、非甾體類抗炎藥、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)抑制劑等；手術(shù)治療如眼表重建術(shù)、電解針燒灼法等；基因治療如內(nèi)皮抑素(ES)、色素上皮衍生因子(PEDF)、血管生成抑素(AS)等；其他治療如激光治療,光動(dòng)力學(xué)療法等。隨著角膜新生血管發(fā)病機(jī)制的深入研究,其治療方法也取得很大的進(jìn)展,但目前臨床上尚無治療角膜新生血管的理想藥物。因此,尋找作用強(qiáng)、副作用少、價(jià)格經(jīng)濟(jì)、更為有效的新生血管抑制劑仍然是角膜新生血管研究的熱點(diǎn)。 熊果酸(ursolic acid, UA)又名烏蘇酸、烏索酸,是一種存在于多種天然植物中的三萜類化合物,具有抗炎、抗菌、抗糖尿病、降低血糖、抗癌、抗促癌等多種生物學(xué)效應(yīng)。近年來對熊果酸的研究發(fā)現(xiàn),它具有抗多種惡性腫瘤血管生成的作用,不但能抑制腫瘤細(xì)胞生長,而且還能抑制腫瘤新生血管的形成。熊果酸能夠抑制血管生成的作用,主要有：①抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞(VEC)的增殖、遷移和管腔形成；②具有抗炎作用,能夠抑制環(huán)氧化酶Ⅱ(Cyclooxygenase-2,COX-2)的表達(dá),減輕炎癥反應(yīng)；③降低VEGF的表達(dá),從而抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、移行；④刺激基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase,MMP-2)和尿激酶,達(dá)到降解細(xì)胞外基質(zhì),促進(jìn)細(xì)胞凋亡,抑制新生血管腔形成的目的。 VEGF是一種具有生物學(xué)效應(yīng)的血管源性肽,是目前研究最多的血管生成因子之一,是一個(gè)強(qiáng)有力的內(nèi)源性血管生長刺激因子,它能夠調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞的發(fā)育、細(xì)胞外基質(zhì)的轉(zhuǎn)型和炎性因子的產(chǎn)生,是一個(gè)特異作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長因子,能夠直接刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的增生并誘導(dǎo)新生血管的生成。研究證明VEGF參與新生血管生成的多個(gè)步驟,是影響新生血管生成最重要的因子之一�；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)是一組活性依賴金屬離子鋅并以細(xì)胞外基質(zhì)成分為水解底物的結(jié)構(gòu)和功能復(fù)雜的蛋白酶家族,主要參與細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的水解和重構(gòu)�；|(zhì)金屬蛋白酶-2,又叫明膠酶A,是目前研究最多的MMPs之一,在細(xì)胞外基質(zhì)合成和降解代謝過程中發(fā)揮著重要的作用,參與新生血管形成。實(shí)驗(yàn)表明,VEGF能夠通過多種細(xì)胞因子途徑作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞,刺激細(xì)胞外基質(zhì)的降解,誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷徙、分化和官腔形成作用。體外實(shí)驗(yàn)也表明,熊果酸能夠抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移,上調(diào)尿激酶和MMP-2的表達(dá),抑制內(nèi)皮細(xì)胞的管腔形成。 目前熊果酸用于角膜新生血管的研究尚無相關(guān)的報(bào)道,因此,我們的實(shí)驗(yàn)通過觀察熊果酸的角膜毒性作用,篩選安全濃度范圍內(nèi)的熊果酸滴眼液,觀察其抑制角膜新生血管的作用及VEGF、MMP-2在角膜新生血管中表達(dá)的影響,初步探討其可能的機(jī)制。 第一部分熊果酸滴眼液對大鼠角膜毒性作用的實(shí)驗(yàn)研究 [目的] 研究熊果酸滴眼液對大鼠角膜的毒性,尋找熊果酸滴眼液局部使用的安全濃度。 [方法] 在無菌條件下將熊果酸溶于含有二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)助溶劑的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS)中,分別制成2mg/ml、4mg/ml、6mg/ml、8mg/ml的熊果酸滴眼液。SPF級雌性SD大鼠48只,隨機(jī)分為PBS滴眼液組、含DMSO助溶劑的PBS滴眼液組、2mg/mlUA組、4mg/mlUA組、6mg/mlUA組、8mg/mlUA組,共6組。各組大鼠均左眼用藥,4/日,共7d。每日對大鼠角膜行裂隙燈顯微鏡檢查并臨床分級,7d后摘取角膜行組織學(xué)檢查。 [結(jié)果] PBS組、含DMSO的PBS組、2mg/ml、4mg/ml、6mg/mlUA組裂隙燈顯微鏡檢查角膜均未見異常,臨床分級為0級,組織學(xué)光鏡檢查未見明顯異常；8mg/mlUA組第5日裂隙燈顯微鏡下見角膜輕度水腫,臨床分級為1級,繼續(xù)用藥未見損害加重,組織學(xué)檢查見角膜上皮層未見表層細(xì)胞缺失,上皮層增厚,排列較紊亂,基底層細(xì)胞排列紊亂,其余各層未見明顯異常。 [結(jié)論] 2mg/ml、4mg/ml、6mg/ml熊果酸滴眼液對大鼠角膜無明顯毒性作用。 第二部分熊果酸滴眼液對大鼠角膜新生血管的抑制作用及機(jī)制的研究 [目的] 研究熊果酸滴眼液對大鼠角膜新生血管的抑制作用及VEGF、MMP-2在角膜新生血管中表達(dá)的影響,探討其初步的機(jī)制。 [方法] 隨機(jī)抽取SD大鼠5只,作為正常對照組,其余50只大鼠建立縫線誘導(dǎo)角膜新生血管模型(左眼),隨機(jī)分為A組：含DMSO的PBS滴眼液(PBS-D組),B組：2mg/mlUA滴眼液,C組：4mg/mlUA滴眼液,D組：6mg/mlUA滴眼液,E組：0.1%地塞米松磷酸鈉滴眼液。每組10只,術(shù)后第1天開始用藥,4/日。第一周每日對大鼠角膜行裂隙燈顯微鏡檢查,第二周每兩天觀察一次。術(shù)后第4、7、14天,在裂隙燈下測量角膜新生血管長度,計(jì)算角膜新生血管面積。術(shù)后4、7、14天切取角膜行組織學(xué)檢查,并采用免疫組織化學(xué)染色法檢測VEGF以及MMP-2的表達(dá)。 [結(jié)果] 大鼠角膜術(shù)后4天,A組CNV面積為(8.11±0.89)mm2、B組為(4.98±1.20)mm2、C組為(2.18±1.08)mm2、D組為(0±0)mm2、E組為(0±0)mm2；術(shù)后7天,A組CNV面積為(25.00±1.75)mm2、B組為(19.97±1.47)mm2、C組為(15.63±1.57)mm2、D組為(11.35±1.39)mm2、E組為(11.97±1.13)mm2；術(shù)后14天,A組CNV面積為(38.00±0.36)mm2、B組為(36.74±0.73)mm2、C組為(27.15±1.14)mm2、D組為(20.83±0.60)mm2、E組為(21.40±0.68)mm2。 角膜CNV面積的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：①從各個(gè)時(shí)間點(diǎn)看,A組CNV面積顯著高于其余四組(P0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；②B、C、D組CNV面積的兩兩比較：在第4、7、14天,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),故三種不同濃度的UA滴眼液能夠顯著抑制大鼠CNV的生長,隨著濃度的增加,抑制能力增強(qiáng),呈濃度依賴性；③B、C組與E組相比,在第4、7、14天,CNV面積均高于E組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；D組與E組相比,在4、7、14天,CNV面積差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 角膜組織切片檢查結(jié)果：A組第4天角膜上皮層局部增生,基質(zhì)層可見新生血管,新生血管周圍有炎性細(xì)胞浸潤；7、14天,角膜增厚,上皮層有炎性細(xì)胞浸潤,基質(zhì)層有大量新生血管形成,官腔較大,伴有炎性細(xì)胞浸潤,內(nèi)皮未見新生血管。B組第4天角膜上皮層有炎性細(xì)胞浸潤,靠近上皮層的基質(zhì)層有新生血管形成,周圍有炎性細(xì)胞浸潤；7、14天,角膜增厚,上皮層紊亂,有炎癥細(xì)胞浸潤,基質(zhì)層有大量新生血管,主要在中上部居多,新生血管周圍可見較多炎癥細(xì)胞浸潤,內(nèi)皮未見新生血管。C組第4天角膜上皮層有炎癥細(xì)胞浸潤,基質(zhì)層偶見新生血管形成,新生血管周圍伴有炎性細(xì)胞浸潤；7、14天,角膜稍增厚,上皮層有炎性細(xì)胞浸潤,基質(zhì)層可見新生血管形成,新生血管周圍有炎性細(xì)胞浸潤,內(nèi)皮層未見新生血管。D、E組第4天角膜上皮完整,未見新生血管結(jié)構(gòu)；7、14天,角膜上皮完整,基質(zhì)層可見少許的新生血管,新生血管周邊有少許炎性細(xì)胞浸潤,內(nèi)皮層未見新生血管。 免疫組化染色結(jié)果：正常角膜上皮和基底膜少量表達(dá)VEGF和MMP-2；A、B、C組-在第4d,角膜全層表達(dá)VEGF,第7d表達(dá)增強(qiáng),第14d表達(dá)明顯減弱；D、E組-第4d角膜的縫線處、上皮層、基質(zhì)層出現(xiàn)VEGF、MMP-2的表達(dá),第7天表達(dá)增強(qiáng),角膜全層均有表達(dá),主要在上皮層和新生血管附近,第14天表達(dá)減弱。 VEGF、MMP-2統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果：①各個(gè)時(shí)間點(diǎn)看,A組VEGF、MMP-2的COD值顯著高于B、C、D、E組(P0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。②B、C、D組的COD值兩兩比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；③B、C組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的COD值均高于E組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；D組與E組相比,在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)上的COD值差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 [結(jié)論] 熊果酸滴眼液可以有效的抑制縫線誘導(dǎo)角膜新生血管的生長,隨著濃度的增加,抑制新生血管作用增強(qiáng),并呈濃度依賴性。熊果酸通過降低VEGF、MMP-2的表達(dá)起到抑制角膜新生血管生長的作用。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R779.65
【目錄】：

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【相似文獻(xiàn)】

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10 陳麗華;江萍;胡學(xué)斌;莫純堅(jiān);王紅俊;王靜;甘緒芹;;內(nèi)皮素1和血管內(nèi)皮生長因子在大鼠角膜新生血管中的表達(dá)[J];中國老年學(xué)雜志;2008年05期

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中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前6條

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中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 程蕾;非洛貝特對大鼠角膜新生血管的影響[D];華中科技大學(xué);2007年

2 董賀;β射線放射治療角膜新生血管的臨床觀察[D];吉林大學(xué);2007年

3 康建芳;選擇性COX-2抑制劑在炎癥相關(guān)角膜新生血管中的作用[D];蘭州大學(xué);2006年

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6 高陽;激肽釋放酶結(jié)合蛋白對角膜新生血管抑制作用研究[D];昆明醫(yī)科大學(xué);2013年

7 董媛;環(huán)氧合酶-2及其抑制劑對角膜新生血管作用的研究[D];華中科技大學(xué);2007年

8 荊國利;貝伐單抗對大鼠角膜新生血管的抑制作用[D];石河子大學(xué);2009年

9 鐘敏;重組人血管內(nèi)皮抑素（恩度）抑制角膜新生血管的實(shí)驗(yàn)研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2012年

10 劉子彬;血管抑素溶液在大鼠角膜新生血管中的作用研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2012年

  本文關(guān)鍵詞：熊果酸滴眼液抑制縫線誘導(dǎo)大鼠角膜新生血管的實(shí)驗(yàn)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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