本文關(guān)鍵詞：以脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)為支架體外培養(yǎng)人角膜上皮細(xì)胞與成纖維細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《山東大學(xué)》 2015年

以脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)為支架體外培養(yǎng)人角膜上皮細(xì)胞與成纖維細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究

張菊  

【摘要】：研究背景角膜透明是維持人眼正常視覺(jué)功能的重要前提條件,但臨床上各種外傷、炎癥、變性等均引起角膜的混濁,造成嚴(yán)重的視力障礙,導(dǎo)致角膜盲。目前,新近不斷開(kāi)展的角膜屈光手術(shù)使得角膜供體材料嚴(yán)重不足以及移植術(shù)后的免疫排斥反應(yīng)導(dǎo)致大多數(shù)角膜病患者得不到及時(shí)有效的角膜移植治療。因此,利用組織工程技術(shù)三維構(gòu)建人類角膜組織等替物成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn),為廣大角膜盲患者帶來(lái)了新的希望。本實(shí)驗(yàn)研究體外培養(yǎng)獲得原代人角膜上皮細(xì)胞與基質(zhì)成纖維細(xì)胞,再以脫細(xì)胞的豬角膜基質(zhì)(Acellular Porcine Corneal Matrix, APCM)為支架材料,探索人角膜細(xì)胞與異種脫細(xì)胞豬角膜的組織相容性,并嘗試構(gòu)建組織工程人角膜前板層。目的人角膜上皮細(xì)胞與角膜基質(zhì)成纖維細(xì)胞體外分離培養(yǎng),種植于脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)材料,以此探討人角膜細(xì)胞與脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)的生物相容性,并進(jìn)一步構(gòu)建人角膜前板層。方法角膜手術(shù)后剩余的角膜緣環(huán)組織去除了鞏膜、虹膜、結(jié)膜等組織后切成幾塊放入中性蛋白酶Ⅱ液中孵育1小時(shí)后,用鑷子將角膜緣細(xì)胞刮除,再將獲得的上皮細(xì)胞團(tuán)用胰酶消化為單個(gè)細(xì)胞。去除上皮的角膜緣組織放于膠原酶Ⅰ中孵育3小時(shí)后,可見(jiàn)有組織塊消失,大量細(xì)胞漂浮,離心后用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸放入孵箱內(nèi)培養(yǎng)。0.5% SDS處理新鮮的豬角膜得到脫細(xì)胞豬角膜支架,H.E.染色,DAPI染色及透射電鏡檢測(cè)支架材料中殘余細(xì)胞成分與膠原成分。培養(yǎng)基孵育APCM支架48小時(shí)后可得到支架浸取液,再將人角膜成纖維細(xì)胞與角膜上皮細(xì)胞分別用獲得的浸取液培養(yǎng),MTT方法分析角膜細(xì)胞的增殖能力。在角膜細(xì)胞接種之前將冰凍的脫細(xì)胞豬角膜支架加入培養(yǎng)基后放入37℃C孵育箱中孵育24小時(shí)。1ml胰島素針將培養(yǎng)的第3代角膜基質(zhì)成纖維細(xì)胞注入APCM材料內(nèi)培養(yǎng)3天,將獲得的第1代角膜緣上皮細(xì)胞接種于APCM支架材料的前板層表面,再共培養(yǎng)10天。H.E.染色,組織免疫熒光與免疫組織化學(xué)的方法用于觀察構(gòu)建人角膜前板層的結(jié)構(gòu)。結(jié)果APCM的H.E.染色未發(fā)現(xiàn)殘余細(xì)胞,DAPI染色未發(fā)現(xiàn)DNA成分。透射電鏡示脫細(xì)胞豬角膜支架內(nèi)未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞成分,可觀察到膠原成分排列整齊規(guī)則。脫細(xì)胞豬角膜支架的浸取物組對(duì)角膜上皮細(xì)胞與基質(zhì)成纖維細(xì)胞的增殖能力與DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)組相比差別分別無(wú)明顯意義。H.E.染色示角膜上皮細(xì)胞接種于APCM支架表面3天后,可觀察到其前表面有單層細(xì)胞樣結(jié)構(gòu),5天后可見(jiàn)到2-3層細(xì)胞,10天后可見(jiàn)到3-5層細(xì)胞。角膜基質(zhì)成纖維細(xì)胞注入到脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)3天可見(jiàn)基質(zhì)內(nèi)部有散在細(xì)胞分布,注射針處較多,并可見(jiàn)膠原成分?jǐn)嗔�；�?天,7天后可見(jiàn)支架材料內(nèi)部細(xì)胞成分不斷增多。構(gòu)建10天的角膜前板層表面有3-5層細(xì)胞,支架內(nèi)部可見(jiàn)散在分布的細(xì)胞,膠原有斷裂的地方。構(gòu)建物的組織形態(tài)與細(xì)胞表型與正常人角膜前板層的組織形態(tài)與細(xì)胞表型基本一致。H.E.染色示構(gòu)建物的前表面可有3-5層細(xì)胞生長(zhǎng),內(nèi)部有散在不均一的細(xì)胞成分。組織免疫熒光觀察構(gòu)建人角膜前板層表層的細(xì)胞成分高表達(dá)標(biāo)志物CK12,材料內(nèi)部可見(jiàn)表達(dá)標(biāo)志物Vimentin。免疫組織化學(xué)示構(gòu)建物的表層可見(jiàn)棕色的特異性標(biāo)志物CK12表達(dá),材料內(nèi)部可見(jiàn)棕色的標(biāo)志物Vimentin的表達(dá)。結(jié)論人角膜細(xì)胞與APCM具有很好的組織相容性,人角膜細(xì)胞能夠較好的生長(zhǎng)于APCM內(nèi),并且體外構(gòu)建人角膜前板層具有可行性,為進(jìn)一步的臨床研究與應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R772.2
【目錄】：

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