本文關(guān)鍵詞：角膜內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)模型的建立，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《南華大學(xué)》 2014年

角膜內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)模型的建立

賀美寧  

【摘要】：目的：從角膜內(nèi)皮細(xì)胞的分離、培養(yǎng)基的選擇、細(xì)胞培養(yǎng)方式及種屬來源方面進(jìn)行篩選和優(yōu)化，尋找最佳的角膜內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)模型的建立方法，為以后角膜內(nèi)皮細(xì)胞在體外的長期有效培養(yǎng)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：本實(shí)驗(yàn)分為四個部分，通過對四個部分結(jié)果的綜合分析得出角膜內(nèi)皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)模型。①剝離帶后彈力層的兔角膜內(nèi)皮片，用雙酶消化法（胰蛋白酶和膠原酶）及組織片法對角膜內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察角膜內(nèi)皮細(xì)胞生長情況，經(jīng)觀察分析得出的細(xì)胞數(shù)量多、污染少的較好分離方法，為后續(xù)階段采用。②選取F99培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基、KSFM培養(yǎng)基三種培養(yǎng)基分別對兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行原代及傳代培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察角膜內(nèi)皮細(xì)胞生長情況。經(jīng)分析討論得出細(xì)胞增殖快、細(xì)胞形態(tài)好的培養(yǎng)基，后續(xù)階段沿用。③采用消化法、與3T3細(xì)胞共培養(yǎng)法、細(xì)胞克隆培養(yǎng)法對兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察角膜內(nèi)皮細(xì)胞生長情況，得出細(xì)胞傳代快、傳代較久的培養(yǎng)方法。④對人、豬、小鼠、兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，并進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及免疫熒光鑒定，選出細(xì)胞形態(tài)維持好、傳代時間長的一種角膜內(nèi)皮細(xì)胞。 結(jié)果：①經(jīng)雙酶消化法培養(yǎng)20天后，兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞呈多邊形或多角星形，細(xì)胞形成單層，未見長梭形的兔角膜基質(zhì)細(xì)胞。組織片法培養(yǎng)2周后可見及部分呈長梭型放射狀生長的兔角膜基質(zhì)細(xì)胞生長其中。②F99培養(yǎng)基中培養(yǎng)的原代兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞在第25天融合成單層，細(xì)胞呈多角形、細(xì)胞數(shù)量多，在三種培養(yǎng)基中細(xì)胞形態(tài)最規(guī)則，細(xì)胞數(shù)目最多，，融合時間最快。第2次傳代的第4天，F(xiàn)99培養(yǎng)基培養(yǎng)的兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)最多，且形態(tài)規(guī)則。③消化法中經(jīng)消化后細(xì)胞貼附快，細(xì)胞形態(tài)好，消化傳代后，細(xì)胞培養(yǎng)4-5天即形成新的單層細(xì)胞，在傳至第10代后仍維持較好的生長態(tài)勢。而兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞與3T3細(xì)胞共培養(yǎng)后，第5天可見明顯的兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞團(tuán)，細(xì)胞呈密集的“鵝卵石”樣形態(tài)。培養(yǎng)至第14天細(xì)胞團(tuán)內(nèi)細(xì)胞數(shù)明顯減少，剩余的細(xì)胞呈細(xì)胞核體積增大、顏色加深的衰老跡象�？寺∨囵B(yǎng)法中角膜內(nèi)皮細(xì)胞在培養(yǎng)7天后形成克隆球，擴(kuò)大培養(yǎng)2代后細(xì)胞體積變大，增殖緩慢。④小鼠角膜內(nèi)皮細(xì)胞在體外傳代26代后仍維持較好的細(xì)胞形態(tài)。兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞在體外培養(yǎng)26代后增殖減緩，細(xì)胞呈長梭形改變，經(jīng)免疫熒光鑒定，此時兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞已向間質(zhì)細(xì)胞分化。人角膜內(nèi)皮細(xì)胞在體外培養(yǎng)從傳代的第4代起細(xì)胞不再呈“鋪路石”樣，細(xì)胞出現(xiàn)體積增大等衰老狀態(tài)；豬角膜內(nèi)皮細(xì)胞在體外培養(yǎng)傳代至第7代細(xì)胞停止增殖。 結(jié)論：利用雙酶消化法分離出小鼠角膜內(nèi)皮細(xì)胞在F99培養(yǎng)基中進(jìn)行消化法培養(yǎng)是角膜內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)的良好模型。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R77
【目錄】：

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本文編號：153132