本文關(guān)鍵詞：新型M細(xì)胞靶向性DNA疫苗的制備及其對CVB3病毒性心肌炎的免疫保護(hù)作用

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【摘要】：黏膜免疫系統(tǒng)作為人體抵抗外來病原體的第一道防線,發(fā)揮重要的抗病毒作用。通過在腸黏膜表面誘生特異性的黏膜免疫應(yīng)答可以有效抵抗病毒和細(xì)菌等的攻擊,從而控制感染程度。因此黏膜疫苗的開發(fā)受到了研究者的親睞,但是由于黏膜疫苗誘生免疫應(yīng)答能力的不足和誘導(dǎo)免疫耐受的傾向,目前只有少量的黏膜疫苗研制成功并投入使用。因此在黏膜疫苗的的研制過程中如何提高其免疫應(yīng)答能力成為一個急需解決的問題。M細(xì)胞是位于派氏結(jié)中的一種特化的上皮細(xì)胞,數(shù)量較少。其基底部是不連續(xù)的,能夠允許淋巴細(xì)胞的自由通過,有利于其抗原轉(zhuǎn)運速率的提高。與其鄰近腸上皮細(xì)胞相比,M細(xì)胞頂膜面缺乏較厚的糖萼結(jié)構(gòu)和粘液,這使得M細(xì)胞頂膜的關(guān)鍵受體易于被細(xì)菌或病毒識別并結(jié)合,促進(jìn)其對外來病原體的識別。因此,我們利用M細(xì)胞這種特殊的結(jié)構(gòu)設(shè)計了一種新型的M細(xì)胞靶向性疫苗。GP2是一類糖蛋白,作為抗原識別受體特異性的表達(dá)于小腸上皮M細(xì)胞頂膜面,是第一個被發(fā)現(xiàn)在人和小鼠M細(xì)胞表面均能表達(dá)的分子,具有更好的特異性。已發(fā)現(xiàn)大腸桿菌Ⅰ型菌毛蛋白FimH能夠與GP2特異性結(jié)合。因此,我們在實驗室原有疫苗CS-pVPl的基礎(chǔ)上引入FimH蛋白,設(shè)計一種新型的黏膜遞送系統(tǒng),從而評估其的誘生CVB3特異性的黏膜免疫應(yīng)答及其對CVB3誘導(dǎo)的病毒性心肌炎的保護(hù)作用。目前我們已有的結(jié)果：一、CS-FimH-DNA遞送系統(tǒng)的構(gòu)建及其特性研究M細(xì)胞靶向遞送系統(tǒng)CS-FimH-pVP1的制備及其理化性質(zhì)的研究：通過EDC活化FimH蛋白的羧基,使其能夠與CS的氨基相互作用進(jìn)而使兩者偶聯(lián)到一起,制備成CS-FimH靶向遞送系統(tǒng)。采用復(fù)合物共沉淀法將已制備好的FimH-CS遞送系統(tǒng)與pcDNA3.1-vp1質(zhì)�；旌现瞥蓪嶒炈璧募{米粒。結(jié)果顯示：(1) 我們的偶聯(lián)效率大約為60%,即接近60%的FimH蛋白與CS發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)。(2) 在CS-FimH靶向系統(tǒng)的保護(hù)下,DNA可以避免被DNaseI酶解,很好的保護(hù)了DNA使其能夠順利到達(dá)靶向部位。通過粒徑檢測發(fā)現(xiàn)該納米粒的粒徑大約在200-400nm之間。二、口服免疫誘生的CVB3特異性免疫應(yīng)答及免疫保護(hù)靶向性疫苗CS-FimH-pVP1口服免疫小鼠后誘導(dǎo)的CVB3特異性黏膜免疫應(yīng)答：我們的實驗組為CS-FimH-pVP1,對照組為CS-pVP1,空載對照組CS-FimH-pcDNA3.0 和 CS-pcDNA3.0。隔周免疫BALB/c小鼠,共免疫四次,每次免疫的質(zhì)�？偭繛�25ug。末次免疫后兩周CVB3攻毒,檢測該疫苗誘生的CVB3特異性的黏膜免疫應(yīng)答。結(jié)果顯示：(1) 靶向性疫苗CS-FimH-pVP1經(jīng)口服后可以誘導(dǎo)高水平的黏膜IgA抗體,但是沒有顯著誘生高水平的血清IgG水平。(2) 靶向性疫苗CS-FimH-pVP1經(jīng)口服后可以促進(jìn)IgA抗體親和力成熟,但是IgG的抗體親和成熟沒有顯著差異。(3) CVB3特異性的T細(xì)胞殺傷活性(CTL)檢測發(fā)現(xiàn)與對照組CS-pVP1免疫的小鼠發(fā)現(xiàn),經(jīng)實驗組CS-FimH-pVP1免疫的小鼠的MLN部位能有誘生較強(qiáng)的CTL,具有統(tǒng)計學(xué)意義。(4) CVB3特異性淋巴細(xì)胞增殖實驗顯示發(fā)現(xiàn)與對照組CS-pVP1免疫的小鼠發(fā)現(xiàn),經(jīng)實驗組CS-FimH-pVP1免疫的小鼠在MLN部位誘生了有效的淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)。(5)IFN-γ+ ELISPOT實驗檢測小鼠脾臟和MLN部位T細(xì)胞分泌IFN-γ+能力,發(fā)現(xiàn)經(jīng)實驗組CS-FimH-pVP1免疫的小鼠MLN部位T細(xì)胞分泌IFN-γ+的能力顯著高于對照組CS-pVP1,但是在脾臟部位T細(xì)胞分泌IFN-γ+的能力與對照組相比并沒有顯著增強(qiáng)。評估靶向性疫苗CS-FimH-pVP1對感染CVB3的小鼠的免疫保護(hù)作用。結(jié)果顯示：(1) 末次免疫兩周后的小鼠經(jīng)CVB3腹腔感染后開始稱量小鼠體重,觀察感染病毒小鼠體重變化情況,我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)靶向性疫苗CS-FimH-pVP1免疫過的小鼠感染CVB3后體重變化較少,體毛順滑,飲食正常。而對照組CS-pVP1小鼠的體重下降較為明顯,且小鼠狀態(tài)較差,活動減少。(2) CK、CK-MB可以作為診斷心肌炎的一個重要指標(biāo)。CK、CK-MB的檢測結(jié)果顯示CS-FimH-pVP1免疫組的CK及CK-MB的指標(biāo)明顯低于CS-pVP1免疫組,具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。說明經(jīng)CS-FimH-pVP1免疫過后的小鼠的心肌炎的癥狀較輕。(3) 由CVB3感染而引起的急性心肌炎以心肌細(xì)胞的壞死和炎性細(xì)胞的浸潤為特征。心肌病理切片結(jié)果顯示空載組小鼠的心肌細(xì)胞損壞嚴(yán)重并夾帶炎癥,炎性淋巴細(xì)胞成團(tuán)分布；而CS-pVPl組小鼠的心肌壞死有所減輕,只有少量的炎性淋巴細(xì)胞聚集在一起成團(tuán)分布和壞死灶的數(shù)量也有所減少；CS-FimH-pVP1組小鼠的心肌細(xì)胞損壞最少,炎性細(xì)胞成團(tuán)現(xiàn)象也明顯減少,無明顯異常,正常心肌細(xì)胞病理切片狀態(tài)相似。(4)CS-FimH-pVP1免疫組小鼠感染病毒后心臟病毒滴度的測定結(jié)果顯示：FimH-CS-pVP1免疫組小鼠心肌細(xì)胞的TCID5o明顯低于對照組CS-pVPl。說明FimH-CS-pVP1免疫組誘生的黏膜免疫應(yīng)答能夠有效清楚小鼠感染的CVB3病毒。(5) 為進(jìn)一步評價各組疫苗誘生的免疫保護(hù)效應(yīng),取末次免疫后兩周的小鼠進(jìn)行致死劑量攻毒結(jié)果發(fā)現(xiàn)空載組在第七天左右全部死亡,對照組CS-pVPl 大約有40%的生存率,而CS-FimH-pVP1免疫組則有大約接近70%的生存率。(6) 小動物超聲成像系統(tǒng)可以監(jiān)測小鼠心臟的收縮和舒張指標(biāo),從而評價小鼠的心功能水平FimH-CS-pVP1免疫組小鼠左心室收縮壓以及射血分?jǐn)?shù)的數(shù)值趨于正常組小鼠,相比于對照組CS-pVPl有顯著提高,說明FimH-CS-pVP1可以明顯改善感染CVB3病毒小鼠的心功能。三、CS-FimH-pVP1增強(qiáng)黏膜免疫應(yīng)答的機(jī)制靶向性疫苗CS-FimH-pVP1口服免疫誘生的CVB3特異性的黏膜免疫應(yīng)答的機(jī)制化探討(1) 體外成功構(gòu)建M細(xì)胞模型。UEA-1的表達(dá)證明我們的M-c ell體外模型構(gòu)建成功。(2) M細(xì)胞對CS-FimH-pVP1納米粒的轉(zhuǎn)運效率的檢測顯示M細(xì)胞對CS-FimH-pVP1納米粒的轉(zhuǎn)運效率隨著時間的增加而逐漸提高,并且顯著高于對照組CS-pVP1。(3) 免疫熒光的方法分析該納米粒的CS-FimH-pVP1是否是通過GP2的介導(dǎo)而被M-cell所攝取,我們可以發(fā)現(xiàn),具有靶向性能力的CS-FimH-pVP1納米粒與GP2具有較多的共定位,而對照組CS-pVP1則幾乎沒有與GP2的共定位。綜上所述,我們成功制備了M細(xì)胞靶向性疫苗C S-FimH-pVP1,并且該疫苗成功誘導(dǎo)了CVB3特異性的黏膜免疫應(yīng)答和免疫保護(hù)作用。這將給CVB3誘導(dǎo)的病毒性心肌炎提供一個新的免疫戰(zhàn)略思想。
【關(guān)鍵詞】：病毒性心肌炎 CVB3 M細(xì)胞 FimH GP2
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R542.21
【目錄】：

• 中文摘要4-8
• Abstract8-12
• 前言12-13
• 第一部分 新型M細(xì)胞靶向性DNA疫苗CS-FimH-pVP1的制備及其特性檢測13-24
• 實驗材料14-15
• 實驗方法15-18
• 實驗結(jié)果18-22
• 討論22-24
• 第二部分 口服免疫CS-FimH-pVP1疫苗誘生的CVB3特異性免疫應(yīng)答24-35
• 實驗材料25
• 實驗方法25-29
• 實驗結(jié)果29-33
• 討論33-35
• 第三部分 口服免疫CS-FimH-pVP1疫苗誘生的CVB3特異性免疫保護(hù)35-44
• 實驗材料35-36
• 實驗方法36-37
• 實驗結(jié)果37-42
• 討論42-44
• 第四部分 口服免疫CS-FimH-pVP1疫苗增強(qiáng)黏膜免疫應(yīng)答的機(jī)制44-51
• 實驗材料44-45
• 實驗方法45
• 實驗結(jié)果45-49
• 討論49-51
• 小結(jié)51-53
• 綜述 M細(xì)胞靶向性疫苗研究進(jìn)展53-58
• 參考文獻(xiàn)58-65
• 致謝65-66

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本文編號：955937