發(fā)布時間：2017-09-14 13:24

  本文關鍵詞：低壓低氧時細胞因子的變化特點及其與心肌纖維化的關系

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【摘要】：心肌纖維化是以過度的細胞外基質沉積為特征,對組織進行纖維性修復,持續(xù)的心肌纖維化可導致心功能紊亂,是許多慢性心臟疾病的晚期共同病理過程。我國幅員遼闊的高原地區(qū)居住人群,常因長期吸入氣體低壓低氧導致肺動脈高壓,引起右心室肥厚、心肌纖維化,并伴有炎癥反應。慢性低壓低氧引起的肺動脈壓增高,心肌嚴重纖維化,使心肌組織的氧供需矛盾更加突出。近年研究發(fā)現,纖維細胞在組織纖維化發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。組織纖維化過程中有多種細胞因子的參與,轉化生長因子(TGF-β)以及它下游信號分子結締組織生長因子(CTGF)被認為是兩個重要的促纖維化細胞因子。同時,炎癥反應所釋放的膜聯蛋白A1(AnxA1)、凱薩琳相關抗菌肽(CRAMP),在組織纖維化過程中發(fā)揮不同的作用。但是在低壓低氧過程中,心肌組織中纖維細胞的變化特點及其作用,TGF-β、CTGF、AnxA1、CRAMP的變化特點及其與心肌纖維化的關系,目前尚未見報道。目的:探討低壓低氧時纖維細胞以及細胞因子(tgf-β、ctgf、anxa1、cramp)的變化特點及其與心肌纖維化的關系。方法:將50只雄性sd大鼠隨機分為常壓常氧飼養(yǎng)組(對照組)與低壓低氧3、7、14和28d飼養(yǎng)組,每組10只大鼠。低壓低氧各組大鼠置于模擬海拔6000m的低壓艙內飼養(yǎng)。于相應時間點通過心導管檢測大鼠平均肺動脈壓(mpap)、右室收縮壓(rvsp)、心肌收縮力指數(dp/dtmax);隨后分別分離其大鼠右心室、左心室及室間隔,并檢測其質量,然后計算右心室肥厚指數(rvhi);通過he染色觀察大鼠右心室壁心肌結構變化;通過masson染色觀察大鼠右心室壁組織膠原含量變化;用免疫熒光化學染色法觀察右心室心肌組織中cd45與Ⅰ型前膠原雙陽性的纖維細胞變化特點;通過熒光定量pcr法(rt2-pcr)檢測右心室心肌組織中col-Ⅰ、fpr1、tgf-β和ctgf的mrna水平,并分析同組內tgf-β、ctgfmrna水平與col-Ⅰmrna水平、右心室肥厚指數的相關性;通過免疫印跡(wb)法分別檢測右心室心肌組織中col-Ⅰ、anxa1、cramp、fpr、tgf-β和ctgf蛋白表達水平。h9c2心肌細胞置于常壓常氧培養(yǎng)(對照組)與常壓缺氧(1%,o2)培養(yǎng)6、12、24h,采用rt2-pcr檢測心肌細胞內anxa1、tgf-β和ctgf的mrna表達水平。結果:1.低壓低氧對心臟血流動力學特性的影響低壓低氧組隨時間延長,mpap逐漸增加,低壓低氧各組分別與對照組相比,其差異具有統(tǒng)計學意義(p0.05);與對照組相比,對低壓低氧時間延長,rvsp逐漸增加,在低壓低氧暴露3、7、14和28d組,顯著增加,且差異具有統(tǒng)計學意義(p0.01);+dp/dtmax在低壓低氧14、28d增加顯著,與對照組相比,其差異具有統(tǒng)計學意義(p0.05)。2.低壓低氧條件下右心室心肌組織結構改變與對照組相比,隨低壓低氧時間延長,rvhi增加,在低壓低氧暴露7、14和28d組顯著增加,且差異具有統(tǒng)計學意義(p0.05);通過he染色觀察到,隨低壓低氧飼養(yǎng)時間延長,各組大鼠右室壁可見心肌細胞逐漸增粗,細胞排列較紊亂,尤其14d和28d組,細胞間纖維明顯增多。3.masson染色觀察大鼠右心室中膠原含量變化masson染色結果顯示,與對照組相比,低壓低氧各組心肌組織內膠原沉積明顯增多,隨時間增加而增加,低壓低氧3d組即可見心肌組織內膠原沉積增多,低壓低氧28d組增加最顯著。與對照組相比,col-Ⅰ蛋白水平隨低壓低氧時間延長表達量增加,且低壓低氧7、14、28d組顯著升高,其差異具有統(tǒng)計學意義(p0.05);col-Ⅰmrna水平隨低壓低氧時間延長表達量增加,且低壓低氧3、7、14、28d組顯著升高,其差異具有統(tǒng)計學意義(p0.05)。4.免疫熒光化學染色觀察大鼠右心室中纖維細胞變化特點免疫熒光化學染色結果顯示,在常氧組心肌組織中未發(fā)現雙重染色的纖維細胞,在低壓低氧3d組心肌組織中雙重染色的纖維細胞明顯增多,在低壓低氧7、14和28d組未發(fā)現雙重染色的纖維細胞。5.低壓低氧條件下大鼠右心室心肌中細胞因子表達變化與對照組相比,低壓低氧3d組右心室心肌組織中tgf-β、ctgfmrna與蛋白表達量均顯著升高(p0.05),低壓低氧28d組右心室心肌組織中tgf-β、ctgf蛋白水平均顯著升高(p0.05),而低壓低氧7、14d組兩細胞因子表達量與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(p0.05);與對照組相比,低壓低氧3、28d組右心室心肌組織中,fpr1mrna與fpr蛋白表達量均顯著升高(p0.05),而低壓低氧7、14d組表達量與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(p0.05);與對照組相比,低壓低氧3、7和14danxa1蛋白含量均增加,且3d增加最顯著(p0.05),而低壓低氧28d表達量與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(p0.05);與對照組相比,低壓低氧cramp蛋白含量隨低壓低氧時間增加,且7、14和28d組表達量顯著升高,與對照組相比其差異具有統(tǒng)計學意義(p0.05)。6.常壓缺氧對培養(yǎng)的h9c2心肌細胞中細胞因子表達的影響與對照組相比,tgf-β的mrna水平隨缺氧時間延長先增加后降低,且6h組增加最顯著,而缺氧6、12h組表達量與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(p0.05);與對照組相比,ctgfmrna水平隨常壓缺氧時間延長而增加,且12、24h組差異有統(tǒng)計學意義(p0.05);與對照組相比,anxa1的mrna水平隨缺氧時間延長先增加后降低,缺氧6h組其差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)。7.tgf-β、ctgf與心肌重塑、心肌纖維化之間的相關關系對照組與低壓低氧0、3、7和14d組,col-Ⅰ與rvhi水平呈顯著正相關(p0.05),說明col-Ⅰ表達水平與右室肥大相關。以col-Ⅰ反映心肌纖維化程度,分析兩因子與纖維化的相關關系,發(fā)現低壓低氧0、3、7和14d組tgf-β與其呈顯著正相關(p0.05);低壓低氧3、7d組ctgf與其呈顯著正相關(p0.05)。分析與rvhi的相關性時,發(fā)現低壓低氧0、3、7、14組tgf-β與其呈顯著正相關(p0.05),低壓低氧3、7、14和28d組與ctgf與其呈顯著正相關(p0.05)。結論:低壓低氧早期即可引起大鼠明顯的心肌纖維化以及纖維細胞的浸潤;隨時間延長,心肌纖維化加劇;低壓低氧早期促纖維化因子tgf-β與ctgf表達明顯上調,隨后回降,ctgf于28天再次增加,anxa1在低壓低氧早期顯著增加,隨后回降;cramp隨著低壓低氧時間延長而逐漸增加。低壓低氧時心肌纖維化與TGF-β、CTGF有關。纖維細胞、TGF-β、CTGF有望成為缺氧心臟病診斷指標以及防治的靶點。
【關鍵詞】：低壓低氧 心肌纖維化 心肌細胞 纖維細胞 細胞因子
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R542.23
【目錄】：

• 符號說明5-7
• 摘要7-13
• ABSTRACT13-19
• 前言19-22
• 第一部分 低壓低氧引起右心室心肌纖維化以及纖維細胞浸潤的特點22-46
• 前言22
• 1 材料方法22-35
• 1.1 主要儀器22-24
• 1.2 主要試劑24-26
• 1.3 試劑的配制26-27
• 1.4 實驗方法27-35
• 2 實驗結果35-43
• 2.1 低壓低氧對肺動脈壓的影響35
• 2.2 低壓低氧對心功能的影響35-36
• 2.3 低壓低氧對心臟組織結構的影響36-38
• 2.4 低壓低氧時心肌纖維化的特點38-41
• 2.5 低壓低氧對心肌中纖維細胞的影響41-43
• 3 討論43-46
• 第二部分 低壓低氧對心肌CTGF和TGF-β 的影響及其與心肌纖維化的關系46-60
• 前言46-47
• 1 材料方法47-52
• 1.1 主要儀器47
• 1.2 主要試劑47-48
• 1.3 試劑的配制48
• 1.4 實驗方法48-52
• 2 實驗結果52-57
• 2.1 低壓低氧對右心室心肌組織中TGF-β 表達的影響52-54
• 2.2 低壓低氧對右心室心肌組織中CTGF表達的影響54-55
• 2.3 低壓低氧時TGF-β、CTGF與RVHI、COL-Ⅰ之間的相關關系55-56
• 2.4 常壓低氧對培養(yǎng)心肌細胞分泌TGF-β 及CTGF的影響56-57
• 3 討論57-60
• 第三部分 低壓低氧對心肌中甲酰肽受體激動劑的影響及其與心肌纖維化的關系60-71
• 前言60-61
• 1 材料方法61-65
• 1.1 主要儀器61
• 1.2 主要試劑61
• 1.3 試劑的配制61
• 1.4 實驗方法61-65
• 2 實驗結果65-68
• 2.1 低壓低氧時右心室心肌組織中CRAMP蛋白表達變化65
• 2.2 低壓低氧時右心室心肌組織中Anx A1蛋白表達變化65-66
• 2.3 低壓低氧時右心室心肌組織中FPR表達變化66-67
• 2.4 常壓缺氧時心肌細胞分泌Anx A1的m RNA表達變化67-68
• 3 討論68-71
• 全文結論71-72
• 參考文獻72-86
• 文獻綜述86-96
• 參考文獻92-96
• 致謝96-97
• 碩士期間發(fā)表文章97

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