本文關(guān)鍵詞：miR-223-3p基因沉默對AMI大鼠CMECs血管生成的影響及其AMI患者益氣活血中藥干預(yù)研究

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【摘要】：目的1.前期實驗研究發(fā)現(xiàn)益氣活血中藥干預(yù)前后miR-223-3p在缺血心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞中具有差異性表達(dá),并發(fā)現(xiàn)miR-223-3p可能通過影響RPS6KB1/HIF-1a信號通路抑制缺血心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞(Cardiac Microvascular Endothelial Cells,CMECs)的遷移和增殖,從而抑制血管生成。本研究在前期實驗的基礎(chǔ)上,通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù),進一步論證miR-223-3p抑制血管生成的機理。2.觀察益氣活血中藥干預(yù)急性心肌梗死(Acute Myocardial Infarction,AMI)患者前后血漿中miR-223-3p的動態(tài)變化,探討miR-223-3p作為急性心肌梗死標(biāo)志物的可行性及靈敏度,為急性心肌梗死的診斷提供更多依據(jù)。方法1.實驗研究(1)在前期實驗的基礎(chǔ)上,獲取病毒載體,建立急性心梗實驗動物模型,觀察正常組(ZC)、模型組(MX)、轉(zhuǎn)染空病毒組(AD-EGFP)、轉(zhuǎn)染miR-223-3p干擾基因組(AD-miR-223-3p)血管新生的生物學(xué)特征,噻唑藍(lán)(MTT)法繪制細(xì)胞生長曲線并檢測細(xì)胞增殖能力,劃痕法測定細(xì)胞遷移能力,倒置相差顯微鏡觀察管腔結(jié)構(gòu)形成情況;確定CMECs血管新生的遷移、增殖、成管的窗口期。(2)根據(jù)四組細(xì)胞增殖、遷移、成管的窗口期,取最佳感染復(fù)數(shù)(MOI)、最佳窗口期,Trizol提取四組總RNA,運用RT-PCR檢測各組miR-223-3P的表達(dá)。(3)Western-blot檢測靶基因及HIF-1α、VEGF、MAPK、PI3K、AKT的蛋白表達(dá)。2.臨床研究(1)選擇AMI住院患者28例,隨機分為實驗組和對照組,每組各14例。實驗組給予常規(guī)西藥聯(lián)合益氣活血中藥治療,對照組給予常規(guī)西藥治療,同時選擇10例健康志愿者入組。在入院后1h、7天、14天檢測兩組miR-223-3p的表達(dá)情況。(2)檢索文獻(xiàn),查找并發(fā)現(xiàn)miR-208及miR-133a急性心梗特異性miRNA的表達(dá)規(guī)律,比較三者的表達(dá)時間窗。結(jié)果1.實驗研究(1)本研究共制作60例大鼠急性心梗模型,其中,成功存活大鼠54只,死亡6只,模型制作成功率90%。(2)腺病毒轉(zhuǎn)染結(jié)果顯示,接種腺病毒24小時后,6組和60組僅有少量綠色熒光表達(dá),轉(zhuǎn)染率為5%和20%;余三組均有大量綠色熒光表達(dá),轉(zhuǎn)染率分別為89%、98%、99%。接種腺病毒48小時后,6組和60組熒光表達(dá)未見增多;600組、6000組熒光表達(dá)強烈,60000組熒光表達(dá)減少,6000組和60000組孔內(nèi)細(xì)胞見細(xì)胞膜破裂,大量細(xì)胞懸浮死亡。(3)ZC組、MX組、AD-EGFP組、AD-miR-223-3p組細(xì)胞增殖窗口期分別為第3天、第6天、第6天、第3天;四組細(xì)胞遷移和成管窗口期分別為第1天和第2天。ZC組和AD-miR-223-3p增殖率、遷移率和成管率均高于MX組和AD-EGFP組(P0.05)。(4)RT-PCR檢測結(jié)果顯示,miR-223-3p表達(dá)水平,與ZC組比較,MX組、AD-EGFP組、AD-miR-223-3p組均上調(diào);與MX組比較,ZC組、AD-miR-223-3p組表達(dá)水平下調(diào)。與ZC組比較,MX組Rps6kb1 m RNA表達(dá)無明顯差異(P0.05),AD-EGFP組Rps6kb1m RNA表達(dá)上調(diào)(P0.01),AD-miR-223-3p組表達(dá)下調(diào)(P0.05);與MX組比較,AD-miR-223-3p組Rps6kb1 m RNA的表達(dá)水平下調(diào)(P0.05),而AD-EGFP組Rps6kb1m RNA表達(dá)上調(diào)(P0.01)。四組細(xì)胞信號通路m RNA表達(dá)結(jié)果顯示,與ZC組相比,MX組和AD-EGFP組MAPK、AKT和VEGF的m RNA表達(dá)均明顯降低(P0.05),AD-miR-223-3p組HIF-1α、PI3K、MAPK和VEGF基因表達(dá)均明顯下調(diào)(P0.05),差異有統(tǒng)計學(xué)意義。與MX組相比,AD-EGFP組AKT、MAPK和VEGF表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義,ZC組和AD-miR-223-3p組HIF-1α、PI3K、AKT和VEGF基因均顯著升高(P0.01)。(5)Western-blot檢測結(jié)果回示,與ZC組比較,MX組、AD-EGFP組和AD-miR-223-3p組靶基因蛋白水平均降低(P0.01或P0.05)。與MX組比較,靶基因蛋白表達(dá)在AD-miR-223-3p組明顯升高,AD-EGFP組無明顯差異。四組細(xì)胞信號通路蛋白表達(dá)結(jié)果顯示,與ZC組相比,MX組和AD-EGFP組MAPK、AKT和VEGF的蛋白表達(dá)均明顯降低(P0.05),AD-miR-223-3p組HIF-1α、PI3K、MAPK和VEGF基因表達(dá)均明顯下調(diào)(P0.05),差異有統(tǒng)計學(xué)意義。與MX組相比,AD-EGFP組AKT、MAPK和VEGF表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義,ZC組和AD-miR-223-3p組HIF-1α、PI3K、AKT和VEGF基因均顯著升高(P0.01)。2.臨床研究(1)心電圖療效比較兩組患者入院1小時心電圖和出院前心電圖結(jié)果。對照組總有效率71.43%,實驗組總有效率85.71%,經(jīng)秩和檢驗,結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)差異,實驗組療效優(yōu)于對照組。(2)血漿miR-223-3p動態(tài)表達(dá)與健康志愿者相比,入院1小時所抽取肘靜脈血中,AMI患者miR-223-3p表達(dá)明顯升高(P=0.000.05)。而對照組與實驗組在治療前miR-223-3p表達(dá)的表達(dá)量無明顯差異(P=0.6250.05)。AMI患者miR-223-3p的表達(dá)于入院是即為高峰階段,治療后呈持續(xù)下降趨勢。治療7天內(nèi)下降最為明顯,而14天后趨于平穩(wěn)。兩組患者miR-223-3p的表達(dá)治療后均較治療前降低,而應(yīng)用益氣活血中藥治療后效果更明顯(P0.05)。結(jié)論1.腺病毒轉(zhuǎn)染缺血CMECs的最佳MOI在300-600之間,轉(zhuǎn)染時間于12-18小時可達(dá)到最大轉(zhuǎn)染效率,而且對細(xì)胞損傷較小。2.miR-223-3p沉默,可以促進CMECs的增殖、遷移、成管過程,進而促進血管新生。3.進一步證實miR-223-3p是通過Rps6kb1/HIF-1α信號通路使血管生成關(guān)鍵分子VEGF、p38 MAPK、PI3K、AKT等表達(dá)水平升高,促進缺血心肌血管生成。4.心肌梗死發(fā)病初始,miR-223-3p較miR-133和miR-208會更早進入窗口期。
【關(guān)鍵詞】：益氣活血中藥 急性心肌梗死 mir-223-3p 腺病毒轉(zhuǎn)染
【學(xué)位授予單位】：山東中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R542.22
【目錄】：

• 提要3-6
• abstract6-10
• 英漢縮略語名詞對照10-15
• 引言15-17
• 第一部分 實驗研究17-51
• （一）miR2233p沉默大鼠缺血CMECs的生物學(xué)特性17-33
• 1 實驗材料17-18
• 1.1 實驗動物17
• 1.2 主要儀器17-18
• 1.3 主要試劑18
• 2 試驗方法18-21
• 2.1 大鼠急性心梗（AMI）模型制作 結(jié)扎法18-19
• 2.2 缺血心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)植塊法19
• 2.3 腺病毒轉(zhuǎn)染大鼠缺血CMECs19-20
• 2.4 各組CMECs的生物學(xué)特性20-21
• 2.5 統(tǒng)計學(xué)分析21
• 3 結(jié)果21-29
• 3.1 大鼠急性心梗模型制作結(jié)果21-22
• 3.2 大鼠缺血CMECs的生長情況22-23
• 3.3 腺病毒轉(zhuǎn)染結(jié)果23-26
• 3.4 細(xì)胞生長曲線26
• 3.5 遷移結(jié)果26
• 3.6 CMECs成管情況26-28
• 3.7 各組CMECs生長窗口期和增殖率、遷移率、成管率情況28-29
• 4 討論29-33
• （二）miR2233p沉默對缺血CMECs血管新生功能的影響33-51
• 1 實驗材料33-37
• 1.1 實驗動物33
• 1.2 主要儀器33-34
• 1.3 主要試劑34
• 1.4 主要溶液配制方法34-37
• 2 實驗方法37-43
• 2.1 RT-PCR檢測miR2233p及相關(guān)靶基因表達(dá)38-41
• 2.2 Western-blot[32]檢測靶基因蛋白表達(dá)41-42
• 2.3 統(tǒng)計學(xué)分析42-43
• 3 結(jié)果43-48
• 3.1 各組miR2233p差異表達(dá)43-45
• 3.2 Rps6kb1的mRNA和蛋白表達(dá)情況45-46
• 3.3 信號通路mRNA和蛋白表達(dá)46-48
• 4 討論48-51
• 第二部分 臨床研究 益氣活血中藥干預(yù)miR2233p對急性心肌梗死診斷價值51-62
• 1 資料與方法51-53
• 1.1 受試者的選擇51-52
• 1.2 受試者分組52
• 1.3 治療藥物52-53
• 1.4 觀察指標(biāo)53
• 1.5 統(tǒng)計學(xué)分析53
• 2 結(jié)果53-59
• 2.1 一般資料53-56
• 2.2 治療前后心電圖療效評價56-57
• 2.3 循環(huán)血中miR2233p表達(dá)情況57-59
• 2.4 miR2233p、miR-133a和miR-208的動態(tài)表達(dá)59
• 3 討論59-62
• 結(jié)語62-63
• 參考文獻(xiàn)63-67
• 綜述67-75
• 參考文獻(xiàn)72-75
• 附錄75-83
• 發(fā)表論文83-85
• 參加課題85-87
• 致謝87-89
• 附件89-99

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本文編號：797609