本文關(guān)鍵詞：MicroRNAs在老年性竇房結(jié)功能減退中的作用及機(jī)制研究

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【摘要】：一、背景與目的老年竇房結(jié)功能減退病人數(shù)量逐年增加,給社會(huì)造成極大負(fù)擔(dān),但是目前診斷這種疾病的檢查方法有限,不能做到早期診斷,給治療帶來很大不便。近些年來關(guān)于疾病生物標(biāo)志物的研究快速發(fā)展,特別是楊寶峰等關(guān)于microRNAs在心肌梗死中作用的研究,不僅啟發(fā)我們提出有關(guān)老年竇房結(jié)功減退疾病生物診斷標(biāo)志物的研究方向,并給我們的研究提供了方法參考。1.microRNAsmicroRNAs是長(zhǎng)度為20-25nt的單鏈非編碼RNAs,其發(fā)揮生物功能主要方式：與mRNAs互補(bǔ)或者非互補(bǔ)方式結(jié)合降低mRNAs穩(wěn)定性,使靶基因的表達(dá)下調(diào);與mRNAs結(jié)合,阻斷蛋白翻譯過程,使靶基因表達(dá)降低。最新的研究證明,nicroRNAs除了在近幾年來的研究證明,microRNAs在組織器官分化發(fā)育與疾病的病理生理過程中發(fā)揮重要作用。此外,對(duì)其在臨床疾病診療中的應(yīng)用研究表明,microRNAs可作為疾病的生物診斷標(biāo)志物,如今在心肌損害、腫瘤以及肝功能監(jiān)測(cè)中已經(jīng)得到廣泛關(guān)注與應(yīng)用。2.老年竇房結(jié)功能減退竇房結(jié)位于界嵴附近,是心臟跳動(dòng)的起搏中心。隨著年齡增長(zhǎng),竇房結(jié)及其周圍組織逐漸纖維化,竇房結(jié)細(xì)胞和各種過渡細(xì)胞發(fā)生凋亡而減少。同時(shí)竇房結(jié)細(xì)胞起搏相關(guān)離子通道蛋白基因表達(dá)變化,起搏電流譜改變�？赡茉谶@兩種機(jī)制的共同作用下,竇房結(jié)起搏功能逐漸減退,具體表現(xiàn)為固有心率的下降和竇房結(jié)傳導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)。由于竇房結(jié)功能減退與心血管嚴(yán)重程度和死亡率明顯相關(guān)而日益受到人們的重視。3.起搏相關(guān)基因起搏相關(guān)基因是一些影響竇房結(jié)細(xì)胞四期自動(dòng)除極的離子通道蛋白基因,以及影響竇房結(jié)內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)的縫隙連接蛋白基因。研究發(fā)現(xiàn),主要有超級(jí)化激活環(huán)核苷酸門控陽(yáng)離子通道基因、L型鈣通道基因、鉀離子通道基因與縫隙連接蛋白基因。隨年齡增長(zhǎng),這些竇房結(jié)內(nèi)基因的表達(dá)可發(fā)生重塑,導(dǎo)致固有心率下降。已經(jīng)通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明。近來的研究證明,microRNAs與細(xì)胞凋亡、炎癥、離子通道的重塑可能存在密切關(guān)系。為了尋找老年竇房結(jié)功能減退的疾病生物診斷標(biāo)志物并闡明其發(fā)病機(jī)制,我們通過探索老年竇房結(jié)功能異常的病人血液中是否存在microRNAs異常表達(dá),通過表達(dá)譜芯片及熒光定量PCR驗(yàn)證,從中挑選出三個(gè)我們認(rèn)為差異性明顯的microRNAs, microRNA-103、microRNA-107、microRNA-1976。然后驗(yàn)證這些小分子物質(zhì)是否通過調(diào)控靶基因的表達(dá)變化,影響心臟功能,為疾病的臨床診斷和治療提供理論依據(jù)。二、方法1.老年竇房結(jié)功能減退患者血清microRNAs表達(dá)譜差異及靶基因預(yù)測(cè)收集老年竇房結(jié)功能減退患者與健康老人的血液。對(duì)血樣進(jìn)行表達(dá)譜芯片分析,挑選差異性表達(dá)明顯的microRNAs。通過Miranda, mirbase, targetscan預(yù)測(cè)靶基因。2.熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)證實(shí)老年竇房結(jié)功能減退患者異常升高的microRNAs靶向作用于竇房結(jié)起搏相關(guān)基因構(gòu)建microRNA表達(dá)質(zhì)粒,Luc-UTR報(bào)告基因,將質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)293T細(xì)胞。通過檢測(cè)luciferase活性,分析microRNA組與空白組熒光素酶活性的差異,判斷microRNA是否對(duì)目的基因3'UTR有作用,明確microRNA是否靶向作用于竇房結(jié)起搏相關(guān)靶基因。3.異常升高的microRNAs對(duì)人ips源性竇房結(jié)細(xì)胞中起搏相關(guān)離子通道蛋白CACNA1C、CACNA1D、CACNA1I、KCNQ1和KCNH2表達(dá)水平的影響通過標(biāo)記HCN4的免疫熒光實(shí)驗(yàn),分析竇房結(jié)細(xì)胞百分比。通過顯微攝像技術(shù)留下質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)前后照片與視頻資料,統(tǒng)計(jì)分析心肌細(xì)胞瞬轉(zhuǎn)前后跳動(dòng)節(jié)律變化,從功能上驗(yàn)證microRNAs影響竇房結(jié)功能。收集細(xì)胞,實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(realtime PCR)技術(shù)和western blot方法,測(cè)定人ips源性竇房結(jié)細(xì)胞,瞬轉(zhuǎn)前后,鈣通道和鉀通道各：mRNA和蛋白表達(dá)水平變化,證明microRNAs通過調(diào)控起搏相關(guān)基因影響竇房結(jié)功能。三、結(jié)果1.老年竇房結(jié)功能減退患者血表達(dá)譜芯片分析與靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果老年竇房結(jié)功能減退患者與健康老人血中,明顯差異性表達(dá)的microRNAs為microRN A-103、microRNA-107、microRNA-1976。通過靶基因預(yù)測(cè)軟件Miranda, mirbase, targetscan得到microRNA-103、microRNA-107的靶基因?yàn)镵CNQ1和KCNH2, microRNA-1976的靶基因?yàn)镃ACNA1C、CACNAID. CACNA1I。2.老年竇房結(jié)功能減退異常升高的microRNAs的作用靶點(diǎn)通過顯著性檢驗(yàn)(一般P0.05)確定存在結(jié)合位點(diǎn)(一般歸一化0.85)。Firefly結(jié)果與Renilla結(jié)果對(duì)比值：1976+ CACNA1I-U1為0.836885,1976+ CACNA1D-U1為0.903125,1976-CACNA1C-U1為0.740264,103a+KCNQ1-U1為0.693293,103a+KCNH2-U1為0.746934,107+KCNQ1-U1為0.820935, 107+KCNH2-U1為0.653819。3.人ips源性竇房結(jié)細(xì)胞株中竇房結(jié)細(xì)胞百分比經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析,發(fā)現(xiàn)被標(biāo)記細(xì)胞占細(xì)胞總量的10%-15%左右。4.人ips源性竇房結(jié)細(xì)胞microRNAs導(dǎo)入前后細(xì)胞跳動(dòng)頻率變化將瞬轉(zhuǎn)后,培養(yǎng)72h的microRNAs組與對(duì)照質(zhì)粒組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,在柱狀圖中可以清楚的看到兩者間存在顯著差異,瞬轉(zhuǎn)microRNA-103組的跳動(dòng)頻率較對(duì)照質(zhì)粒組減慢。瞬轉(zhuǎn)microRNA-107組的跳動(dòng)頻率較對(duì)照質(zhì)粒組減慢。瞬轉(zhuǎn)microRNA-1976組的跳動(dòng)頻率較對(duì)照質(zhì)粒組約減慢。5.人ips源性竇房結(jié)細(xì)胞microRNAs導(dǎo)入前后鈣通道與鉀通道表達(dá)變化通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù),得到microRNAs的靶基因mRNA的表達(dá)水平的變化,microRNA-103、microRNA-107的靶基因mRNA (KCNH2、KCNQ1)均表達(dá)水平升高,而microRNA-1976使靶基因CACNA1C、CACNA1D的mRNA的表達(dá)水平降低,對(duì)于CACNA1I的作用不是太明顯。蛋白免疫印跡的結(jié)果表明,microRNA-103、microRNA-107使KCNH2、KCNQ1的蛋白上調(diào)表達(dá),microRNA-1976使CACNA1C、CACNA1D與CACNA1I編碼的蛋白下調(diào)表達(dá),其結(jié)果與RTPCR的結(jié)果一致。四、結(jié)論：1.通過我們的研究發(fā)現(xiàn)了老年竇房結(jié)功能減退患者血中差異性表達(dá)的microRNAs, microRNA-103、microRNA-107、microRNA-1976,提示其有望應(yīng)用于疾病的診斷。2.驗(yàn)證了差異性表達(dá)的microRNAs在起搏相關(guān)基因存在作用靶點(diǎn)。3.驗(yàn)證microRNA-103、microRNA-107使人竇房結(jié)細(xì)胞中的KCNH2、 KCNQ1表達(dá)上調(diào),調(diào)節(jié)竇房結(jié)跳動(dòng)節(jié)律的變化,而microRNA-1976通過下調(diào)鈣離子通道蛋白表達(dá),調(diào)控竇房結(jié)的跳動(dòng)節(jié)律。從細(xì)胞水平上驗(yàn)證了microRNAs調(diào)控離子通道蛋白的表達(dá)變化,是老年竇房結(jié)電生理重塑導(dǎo)致功能減退的分子基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：老年 竇房結(jié) microRNA 離子通道蛋白
【學(xué)位授予單位】：昆明理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R541.7
【目錄】：

• 摘要6-10
• Abstract10-21
• 縮略詞21-23
• 第一部分 microRNA分子生物學(xué)特性及竇房結(jié)細(xì)胞電生理23-41
• 1.1 microRNAs概述23-30
• 1.1.1 microRNA生化23-24
• 1.1.2 microRNAs組織分布特異性24-27
• 1.1.3 microRNAs與心臟疾病27-30
• 1.2 心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)30-38
• 1.2.1 心臟解剖基礎(chǔ)30-31
• 1.2.2 心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)31-32
• 1.2.3 心肌細(xì)胞電生理32-37
• 1.2.4 竇房結(jié)的解剖與功能37-38
• 1.3 小結(jié)38-41
• 第二部分 老年竇房結(jié)功能減退患者血漿microRNAs表達(dá)譜差異及靶基因預(yù)測(cè)41-45
• 2.1 前言41
• 2.2 材料和方法41-42
• 2.3 結(jié)果42-45
• 第三部分 熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)證實(shí)老年竇房結(jié)功能減退患者異常升高的microRNAs靶向作用于竇房結(jié)起搏相關(guān)基因45-49
• 3.1 前言45
• 3.2 材料和方法45-47
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果47-49
• 第四部分 異常升高的microRNAs對(duì)人ips源性竇房結(jié)細(xì)胞中起搏相關(guān)離子通道蛋白CACNA1C、CACNA1D、CACNA11、KCNQ1和KCNH2表達(dá)水平的影響49-87
• 4.1 前言49
• 4.2 材料49-55
• 4.2.1 材料來源49-50
• 4.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑及主要配置方法50-54
• 4.2.3 主要儀器54-55
• 4.3 實(shí)驗(yàn)方法55-71
• 4.3.1 質(zhì)粒提取55-57
• 4.3.2 細(xì)胞復(fù)蘇及支原體檢測(cè)57-60
• 4.3.3 瞬轉(zhuǎn)前細(xì)胞照片、視頻資料收集60
• 4.3.4 免疫熒光60-61
• 4.3.5 免疫熒光圖片信息采集61
• 4.3.6 質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)61-63
• 4.3.7 瞬轉(zhuǎn)后細(xì)胞照片、視頻資料收集63
• 4.3.8 RNA提取63-64
• 4.3.9 RNA濃度及RNA質(zhì)量測(cè)定64-65
• 4.3.10 cDNA的合成65-66
• 4.3.11 引物設(shè)計(jì)與合成由上海迅捷生物工程有限公司完成66-67
• 4.3.12 實(shí)時(shí)熒光定量PCR67-68
• 4.3.13 蛋白的免疫印跡分析68-71
• 4.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果71-87
• 4.4.1 質(zhì)粒提取檢測(cè)結(jié)果71-72
• 4.4.2 支原體檢測(cè)結(jié)果72-73
• 4.4.3 細(xì)胞免疫熒光結(jié)果73-74
• 4.4.4 質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)心肌細(xì)胞結(jié)果74-77
• 4.4.5 質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)心肌細(xì)胞前,與質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)培養(yǎng)72h后,不同組別不同視野心肌細(xì)胞跳動(dòng)節(jié)律變化統(tǒng)計(jì)77-82
• 4.4.6 RNA提取結(jié)果分析82-83
• 4.4.7 rtPCR結(jié)果分析83-85
• 4.4.8 蛋白免疫印跡結(jié)果分析85-87
• 第五部分 討論87-93
• 第六部分 展望93-94
• 致謝94-95
• 參考文獻(xiàn)95-108
• 碩士期間發(fā)表論文108

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