本文關(guān)鍵詞：微管解聚對心肌細(xì)胞電生理特性的影響及微管定量分析方法研究

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【摘要】：微管是心肌細(xì)胞的主要骨架成分,參與維持細(xì)胞形態(tài)等一系列重要生理活動�！靶菘诵摹崩碚撜J(rèn)為,在嚴(yán)重?zé)齻l(fā)的心功能損害中,缺氧導(dǎo)致的微管解聚至關(guān)重要。然而,微管解聚對作為心肌細(xì)胞活性與功能基礎(chǔ)的電生理方面的作用一直缺乏系統(tǒng)的研究和觀察。另外,高度動態(tài)平衡的微管系統(tǒng)的研究一直依賴于顯微成像技術(shù),這種傳統(tǒng)的方法存在觀察者主觀偏差等致命缺陷。因此,探討可客觀量化微管形態(tài)變化的新方法將為缺氧引起的微管解聚帶來新的認(rèn)識。本研究以大鼠乳鼠心肌細(xì)胞作為研究對象,利用固定濃度、固定時間的秋水仙堿處理模擬特定缺氧環(huán)境下微管解聚的效應(yīng)。將上述微管解聚效應(yīng)作為單一實驗因素來觀察大鼠乳鼠心肌細(xì)胞各項電生理指標(biāo)變化,以分析單純微管解聚所引起的電生理特性改變及機(jī)制。同時,基于標(biāo)記微管形態(tài)的H9C2心肌細(xì)胞熒光圖像,用灰度直方圖(GLH)特征參數(shù)比較量化了秋水仙堿和缺氧引起微管解聚后微管形態(tài)變化,以進(jìn)一步明確兩者的對照關(guān)系。一、材料與方法1.體外SD大鼠乳鼠心肌細(xì)胞分離培養(yǎng),分為正常對照組和微管解聚組。觀察秋水仙堿處理后微管變化:免疫熒光染色標(biāo)記α微管蛋白,激光共聚焦顯微鏡下觀察微管形態(tài)變化;蛋白免疫印跡(WB)實驗檢測游離/聚合態(tài)α微管蛋白的含量變化。2.體外SD大鼠乳鼠心肌細(xì)胞分離培養(yǎng),分為正常對照組和微管解聚組。觀察秋水仙堿處理后電生理特性及耗氧量變化:倒置顯微鏡下實時錄制自主搏動以計算其搏動頻率;全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄心肌細(xì)胞動作電位(AP)、延遲整流型鉀離子通道電流(IK)和L型鈣離子通道電流(ICa-L);氧微電極系統(tǒng)測定培養(yǎng)液中溶解氧濃度,間接反應(yīng)心肌細(xì)胞耗氧量。3.H9C2心肌細(xì)胞培養(yǎng),分為正常對照組、缺氧組和秋水仙堿組。基于熒光標(biāo)記微管的數(shù)字圖像進(jìn)行定量分析:α微管蛋白免疫熒光染色,激光共聚焦顯微鏡獲取微管數(shù)字圖像,Matlab7.0等軟件進(jìn)行單細(xì)胞分割、去噪、等比例分區(qū)等處理并提取GLH特征參數(shù)。二、主要結(jié)果1.正常對照組乳鼠心肌細(xì)胞微管呈現(xiàn)線性管狀形態(tài),結(jié)構(gòu)清晰完整,以核周為中心放射狀分布。微管解聚組細(xì)胞微管卷曲,念珠樣改變,結(jié)構(gòu)遭破壞而斷裂,呈彌漫性分布,熒光強(qiáng)度也降低。微管解聚組聚合態(tài)微管蛋白含量降低,游離態(tài)微管蛋白含量增高。2.微管解聚后乳鼠心肌細(xì)胞較正常對照組自主搏動頻率明顯升高,耗氧量也相應(yīng)增加。3.微管解聚組乳鼠心肌細(xì)胞AP形態(tài)發(fā)生明顯變化,復(fù)極化平臺期不明顯,動作電位時程(APD)明顯縮短,靜息電位(RP)和動作電位振幅(AMP)未見明顯變化。4.微管解聚組乳鼠心肌細(xì)胞IK電流增強(qiáng),其I-V曲線較正常對照組上移,激活后各測試電壓下(0-40mV)IK電流密度峰值均增加;然而,ICa-L電流未見變化,其I-V曲線與正常對照組基本重疊,激活后各測試電壓下(-30-50mV)ICa-L電流密度峰值無明顯改變。5.與正常對照組相比,缺氧組和秋水仙堿組H9C2心肌細(xì)胞微管形態(tài)量化參數(shù)呈類似的變化趨勢;且兩組均是在與細(xì)胞膜連接的正端更明顯。三、結(jié)論1.微管解聚后IK增強(qiáng),ICa-L電流不變,使得AP復(fù)極化增快,進(jìn)而縮短APD,增快心肌細(xì)胞自主搏動頻率,增加其耗氧量,這可能是造成或加重心肌缺氧損害的重要因素。2.基于熒光圖像,以GLH特征參數(shù)(均值,方差,偏度,峰度,能量,熵)量化微管形態(tài)是切實可行的。該方法證實:缺氧及秋水仙堿處理后心肌細(xì)胞整體及區(qū)域內(nèi)微管形態(tài)量化特征相類似,存在對照關(guān)系。微管熒光圖像形態(tài)學(xué)灰度分析法能更加準(zhǔn)確地分析判斷缺氧心肌細(xì)胞微管的變化及其程度,具有較大意義。
【關(guān)鍵詞】：心肌細(xì)胞 缺氧 微管 電生理 灰度直方圖
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R542.2
【目錄】：

• 英文縮寫一覽表4-5
• 英文摘要5-8
• 中文摘要8-10
• 第一章 前言10-12
• 第二章 微管解聚對大鼠乳鼠心肌細(xì)胞電生理特性的影響12-32
• 2.1 材料與方法12-24
• 2.2 結(jié)果24-30
• 2.3 討論30-31
• 2.4 小結(jié)31-32
• 第三章 基于熒光圖像的心肌細(xì)胞微管定量分析32-46
• 3.1 材料與方法32-39
• 3.2 結(jié)果39-44
• 3.3 討論44-45
• 3.4 小結(jié)45-46
• 全文結(jié)論46-47
• 參考文獻(xiàn)47-50
• 文獻(xiàn)綜述一 微管影響心肌細(xì)胞離子通道活動50-57
• 參考文獻(xiàn)54-57
• 文獻(xiàn)綜述二 基于圖像的微管定量分析57-62
• 參考文獻(xiàn)60-62
• 附錄62-65
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的文章65-66
• 致謝66

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 姚宇華,熊江輝,梁仲剛,嚴(yán)洪,李瑩輝;心肌細(xì)胞微管圖像的灰度特征分析(英文)[J];航天醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)工程;2004年05期

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本文編號：708910