本文關(guān)鍵詞：桃仁蛋白源腎素和ACE雙重抑制肽的制備、分離和純化

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【摘要】：高血壓,是一種全球人類最常見的慢性��；也是引起腦血管病、心臟病、腎臟病的發(fā)生和死亡的最主要因素。治療和預(yù)防高血壓病是建設(shè)健康中國(guó)的重要課題。目前,在血壓調(diào)節(jié)系統(tǒng)中,單獨(dú)的腎素抑制劑和ACE抑制劑是治療高血壓常用的有效藥物。但是,單獨(dú)使用腎素抑制劑和ACE抑制劑在臨床實(shí)驗(yàn)中存在不良反應(yīng)。聯(lián)合使用ACE抑制劑和腎素抑制劑在降低血壓的同時(shí),還可以減少對(duì)其它器官的損傷。食源性的降血壓肽與合成的降血壓抑制劑相比,溫和、安全,能減少對(duì)靶器官的傷害,還兼具其它功能特性,且易于吸收。因此,越來越多的研究者傾向于從食物中獲取降血壓多肽。本文的研究工作主要是桃仁分離蛋白降血壓肽的制備及其分離純化。首先以桃仁分離蛋白為原料,通過不同的蛋白酶水解,以水解度(degree of hydrolysis, DH)、ACE抑制率和腎素抑制率為評(píng)價(jià)指標(biāo),分別研究了其酶解工藝,優(yōu)化了酶解工藝參數(shù)；其次桃仁分離蛋白酶解物為研究對(duì)象,通過超濾、大孔吸附樹脂、凝膠過濾色譜、高效液相色譜等手段分離、純化酶解產(chǎn)物,為桃仁分離蛋白資源的深入開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。得到了以下結(jié)果：1)桃仁分離蛋白水解酶的選擇實(shí)驗(yàn)。用復(fù)合蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、堿性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶以及聯(lián)合使用胃和胰蛋白酶,對(duì)桃仁分離蛋白進(jìn)行酶解,以DH、ACE抑制率和腎素抑制率作為評(píng)價(jià)指標(biāo),結(jié)果發(fā)現(xiàn),堿性蛋白酶制備的酶解物具有較高的ACE抑制率和腎素抑制率。因此,選擇堿性蛋白酶作為實(shí)驗(yàn)用酶。2)桃仁分離蛋白酶解工藝參數(shù)的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。以桃仁分離蛋白為底物,采用堿性蛋白酶水解桃仁分離蛋白制備腎素和ACE雙重抑制肽。以體外ACE抑制率和腎素抑制率為評(píng)價(jià)指標(biāo),通過單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)酶解溫度、酶解pH值、底物質(zhì)量濃度和加酶量等酶解工藝參數(shù)進(jìn)行研究,并用響應(yīng)面法優(yōu)化酶解工藝參數(shù)。結(jié)果表明,堿性蛋白酶水解桃仁分離蛋白制備腎素和ACE雙重抑制肽的最佳工藝為酶解溫度50.6℃,酶解pH值8.02,加酶量3.06%。得到的酶解產(chǎn)物ACE抑制率為69.03%,腎素抑制率為57.61%。3)利用超濾膜和大孔吸附樹脂對(duì)桃仁分離蛋白降血壓肽進(jìn)行分離純化。分別選用截留分子量(MWCO) 50KDa、10 KDa、5 KDa、1 KDa的膜對(duì)桃仁分離蛋白酶解物進(jìn)行超濾分離,結(jié)果發(fā)現(xiàn),超濾后各組分ACE抑制率和腎素抑制率存在較大差異,其中,MWCO為1 KDa透過液組分ACE抑制率和腎素抑制率均最高。采用大孔吸附樹脂對(duì)超濾后的活性組分進(jìn)行脫鹽處理,考察了LSA-21、D101、XDA-6、DA201-C、LX-1180、AB-8六種大孔吸附樹脂對(duì)桃仁分離蛋白降血壓肽的吸附洗脫效果,發(fā)現(xiàn)DA201-C對(duì)桃仁分離蛋白降血壓肽的分離效果為最佳,其吸附率達(dá)到68.84%,解析率達(dá)到80.75%。因此,選擇大孔樹脂DA201-C進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。綜合考察樣品的上樣濃度、pH、鹽濃度、上樣流速、乙醇洗脫劑濃度、洗脫劑流速和洗脫劑體積等因素對(duì)桃仁分離蛋白降血壓肽的純化效果的影響,最后得出其最佳分離工藝：上樣濃度20 mg/mL、pH 7.0、上樣流速0.5 mL/min、乙醇濃度70%、洗脫流速1.0 mL/min。在此條件下,70%乙醇洗脫液組分具有最高的ACE抑制活性和腎素抑制活性。4) Sephadex G-15凝膠色譜和半制備RP-HPLC對(duì)桃仁分離蛋白降血壓肽分離、純化和精制。經(jīng)過大孔樹脂脫鹽純化后的解析液再通過SephadexG-15純化,在樣品濃度150 mg/mL、洗脫流速0.8 mL/min、上樣體積1 mL的條件下,得到3個(gè)組分,其中組分G2的ACE抑制活性和腎素抑制活性相對(duì)最高。將組分G2通過半制備RP-HPLC進(jìn)行分離純化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在5個(gè)組分中,組分c的ACE抑制率和腎素抑制率最高。
【關(guān)鍵詞】：桃仁分離蛋白 血管緊張素抑制活性 腎素抑制肽 血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽
【學(xué)位授予單位】：陜西科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R544.1;TS201.2
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-12
• 中英文縮寫對(duì)照12-13
• 1 緒論13-22
• 1.1 桃仁蛋白及其研究進(jìn)展13-14
• 1.1.1 桃仁的概述13
• 1.1.2 桃仁蛋白13-14
• 1.2. 腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)14-16
• 1.2.1 血管緊張素轉(zhuǎn)換酶15
• 1.2.2 腎素抑制劑15-16
• 1.2.3 重抑制劑的應(yīng)用16
• 1.3 生物活性多肽16-19
• 1.3.1 食物蛋白源降血壓肽的研究進(jìn)展17
• 1.3.2 食物蛋白源降血壓肽的制備和分離純化17-19
• 1.4 研究目的與意義19-20
• 1.5 研究?jī)?nèi)容20-22
• 2 桃仁蛋白酶解物的制備22-38
• 2.1 引言22
• 2.2 實(shí)驗(yàn)儀器與材料22
• 2.2.1 實(shí)驗(yàn)材料和試劑22
• 2.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器22
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法22-27
• 2.3.1 PKPI的制備工藝流程22-24
• 2.3.2 桃仁蛋白的酶解24
• 2.3.3 水解度測(cè)定24
• 2.3.4 ACE抑制活性測(cè)定24-25
• 2.3.5 測(cè)定腎素活性方法25-26
• 2.3.6 蛋白酶的篩選26
• 2.3.7 酶解物的抗消化性研究26
• 2.3.8 酶解工藝的單因素實(shí)驗(yàn)26-27
• 2.3.9 響應(yīng)面優(yōu)化研究27
• 2.3.10 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)27
• 2.4 結(jié)果與分析27-37
• 2.4.1 蛋白酶的篩選27-28
• 2.4.2 堿性蛋白酶酶解物的抗消化性研究28
• 2.4.3 單因素實(shí)驗(yàn)28-32
• 2.4.4 響應(yīng)面分析32-36
• 2.4.5 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)36-37
• 2.5 本章小結(jié)37-38
• 3 桃仁蛋白源降血壓肽的初步分離38-55
• 3.1 引言38
• 3.2 實(shí)驗(yàn)儀器與材料38
• 3.2.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑38
• 3.2.3 實(shí)驗(yàn)儀器38
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法38-44
• 3.3.1 桃仁分離蛋白酶解物的制備38-39
• 3.3.2 桃仁分離蛋白Alcalase 2.4L酶解物的肽圖譜測(cè)定39-40
• 3.3.3 桃仁蛋白Alcalase 2.4L酶解物的超濾分離40
• 3.3.4 大孔吸附樹脂脫鹽精制40-43
• 3.3.5 多肽含量的測(cè)定43
• 3.3.6 ACE抑制率的測(cè)定43
• 3.3.7 腎素抑制率的測(cè)定43
• 3.3.8 桃仁蛋白Alcalase 2.4L酶解物脫鹽后的肽圖譜測(cè)定43-44
• 3.4 結(jié)果與分析44-53
• 3.4.1 桃仁蛋白Alcalase 2.4L酶解物的超濾分離44-45
• 3.4.2 大孔樹脂分離純化桃仁蛋白多肽45-52
• 3.4.3 桃仁分離蛋白酶解物樹脂純化后活性52
• 3.4.4 桃仁分離蛋白酶解物原液、超濾后和樹脂純化后的肽圖譜52-53
• 3.5 本章小結(jié)53-55
• 4 桃仁蛋白源降壓肽的分離、純化和精制55-65
• 4.1 引言55
• 4.2 實(shí)驗(yàn)儀器與材料55-56
• 4.2.1 實(shí)驗(yàn)材料和試劑55-56
• 4.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器56
• 4.3 實(shí)驗(yàn)方法56-57
• 4.3.1 葡聚糖凝膠的預(yù)處理56
• 4.3.2 葡聚糖凝膠分離純化降血壓肽的實(shí)驗(yàn)56-57
• 4.3.3 半制備反向高效液相分離純化降血壓肽57
• 4.3.4 RP-HPLC二次分離純化降血壓肽57
• 4.3.5 ACE抑制率的測(cè)定57
• 4.3.6 腎素抑制率的測(cè)定57
• 4.4 結(jié)果與分析57-64
• 4.4.1 Sephadex G-15對(duì)桃仁分離蛋白酶解物的分離57-61
• 4.4.2 SephadexG-15色譜對(duì)桃仁分離蛋白酶解物的分離效果61-62
• 4.4.3 半制備反向高效液相分離純化桃仁分離蛋白酶解物62-64
• 4.5 本章小結(jié)64-65
• 5 結(jié)論與創(chuàng)新點(diǎn)65-67
• 5.1 結(jié)論65-66
• 5.2 創(chuàng)新點(diǎn)66-67
• 致謝67-68
• 參考文獻(xiàn)68-75
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄75-76

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