本文關鍵詞：TNFAIP8L1在動脈粥樣硬化中的作用研究

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【摘要】：研究背景隨著經(jīng)濟的發(fā)展及人民生活水平的大幅提高,心腦血管疾病(cardiovascular diseases)成為導致人類死亡的主要疾病之一,嚴重威脅人類生命健康。作為心腦血管疾病中最常見的動脈粥樣硬化(Atherosclerosis, AS)是發(fā)生在大中型動脈上的一種慢性進行性病變,其發(fā)生的始動因素是內皮細胞功能的損傷。內皮細胞損傷導致血管內皮的完整性遭到破壞,脂質在內膜下的沉積和氧化,激活包括巨噬細胞在內的一系列免疫細胞,誘導粥樣斑塊的發(fā)生。此外,內皮細胞功能損傷可導致內皮細胞凋亡,促進斑塊形成,實驗亦證實粥樣斑塊區(qū)域內皮細胞凋亡明顯增加。所以內皮細胞的完整性和功能活性在阻止動脈粥樣硬化疾病的發(fā)生進展過程中起重要作用,因此,阻止內皮細胞的功能損傷在預防動脈粥樣硬化的發(fā)生上其關鍵作用。引起動脈粥樣硬化發(fā)生的因素包括環(huán)境因素和基因因素,其中氧化應激在動脈粥樣硬化中的作用越來越受到重視。氧化應激(Oxidative Stress)反應能引起機體平衡失調,現(xiàn)已被公認為引起動脈粥樣硬化的重要因素之一,它能使活性氧(ROS, Reactive Oxygen Species)與抗氧化系統(tǒng)間產(chǎn)生一系列適應性反應。活性氧包括羥基自由基(OH-)、次氯酸鹽(OCl-)、超氧陰離子基團(O2-)和非基團氧化物H2O2。內皮細胞對氧化應激異常敏感,活性氧的上調可以損傷血管內皮細胞功能導致血管炎癥最終發(fā)展成動脈粥樣硬化。H2O2可以直接誘導氧化應激產(chǎn)生過多的活性氧以至引起DNA、脂質及蛋白的損傷而導致細胞的凋亡,血管內皮細胞的凋亡可以增加動脈粥樣硬化發(fā)生率。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)與血管內皮細胞氧化還原狀態(tài)間的失衡會導致血管細胞功能失調,作為MAPK家族成員的Erks. JNKs和P38 MAPK在ROS誘導的應激反應中起重要的協(xié)調作用。PI3K/Akt信號通路、FoxO3a及NF-κB信號通路在氧化應激所誘導的內皮細胞凋亡中也起到重要作用。TIPE1 (TNFAIP8L1, TNF-α-induced protein 8-like 1)與TIPE (TNFAIP8)、TIPE2 (TNFAIP8L2)、TIPE3 (TNFAIP8L3)同為腫瘤壞死因子α誘導蛋白8家族(tumor necrosis factor-alpha-induced protein 8 (TNFAIP8) family)成員,這四種成員間擁有大量的同源序列。TIPE是這個家族成員中首先被確認的,含有一個死亡結構域并且調控細胞的生長和凋亡。雖然已有文章報道TIPE1蛋白廣泛表達于C57小鼠組織與細胞系中,但有關其功能研究的文章較少,特別是TIPE1在動脈粥樣硬化發(fā)生中的作用未見報道。因此,本課題以原代培養(yǎng)的人臍靜脈內皮為靶細胞,研究在氧化應激時TIPE1對內皮細胞功能的調控作用,并以高脂喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠誘導動脈粥樣硬化斑塊模型觀察TIPE1的表達在動脈粥樣硬化的發(fā)生進展中所起的作用,以期明確TIPE1在動脈粥樣硬化發(fā)生中的作用并揭示其分子機制。實驗方法1.細胞實驗研究TIPE1在氧化應激時對血管內皮細胞功能的影響1.1人臍靜脈內皮細胞的獲取取自齊魯醫(yī)院健康新生兒臍帶,無菌條件下分離獲取臍靜脈內皮細胞,M199培養(yǎng)基加10%胎牛血清進行培養(yǎng),傳至第三至第十代的細胞用于實驗。1.2氧化應激對內皮細胞表達TIPE1的影響以不同濃度的H202刺激內皮細胞,或者同一濃度刺激不同的時間,收集洗滌細胞提取細胞總RNA,逆轉錄為cDNA進行實時熒光定量PCR或普通PCR,同時收集H202處理的細胞提取蛋白進行western blot檢測TIPE1表達狀況。1,3氧化應激時TIPE1對血管內皮細胞功能的影響1.3.1 TIPE1過表達對血管內皮細胞氧化應激時生成ROS及抗氧化酶的影響分別對轉染TIPE1表達質粒pRK5-TIPE1及空載體pRK5轉染人臍靜脈內皮細胞,24小時后,以濃度為100 μmol/L H2O2刺激細胞0、30min,收集細胞以流式細胞儀檢測細胞內ROS的生成情況并分析統(tǒng)計結果。H202分別對轉染pRK5及pRK5-TIPE1的細胞刺激0、2h后,收集細胞提取總RNA,逆轉錄后進行實時定量PCR檢測抗氧化酶CAT、SOD2、GPX的基因表達情況,并收集H202刺激0、15、30 mmin的細胞,western blot檢測轉錄因子FoxO3a蛋白的活化情況。1.3.2 TIPE1過表達對內皮細胞生長的影響運用CCK-8的方法檢測在TIPE1過表達的情況下,細胞的生長情況。1.3.3 TIPE1過表達在氧化應激時對血管內皮細胞死亡的影響TIPE1在過表達的情況下,用H202刺激細胞,分別用臺盼藍染色、AnnexinV/PI的方法檢測細胞的死亡情況,細胞周期分析TIPE1過表達對細胞周期分布的影響,與轉染pRK5組對比分析結果,得出結論。此外,用western blot檢測促凋亡分子caspase3的活化、Bax的表達情況及抑凋亡分子Bcl2的表達情況。1.3.4 TIPE1過表達對內皮細胞攝取ox-LDL的影響在TIPE1過表達的情況下,用ox-LDL刺激內皮細胞,oil-red-O染色,檢測其對ox-LDL的攝取情況。1.4干擾TIPE1基因對內皮細胞功能的影響轉染TIPE1小干擾RNA及無關對照序列,流式細胞術檢測細胞內ROS的生成,CCK-8檢測內皮細胞的生長,臺盼藍染色檢測細胞的死亡。1.5 TIPE1在氧化應激時對內皮細胞信號通路的影響在TIPE1過表達的情況下,用H202刺激內皮細胞,提取總蛋白,通過western blot方法,檢測Akt、MAPK、IκB信號通路的活化情況。2體內實驗購自北京科奧協(xié)力公司6-8w齡健康雄性ApoE-/-小鼠,分為實驗組和對照組,在高脂喂養(yǎng)一周后,分別對兩組注射TIPE1慢病毒和對照慢病毒。在高脂喂養(yǎng)8w后,處死小鼠,取其心臟主動脈根部冰凍切片以進行油紅O染色和HE染色,腹主動脈以進行大體油紅O染色,留取血清檢測脂蛋白水平。研究結果1.氧化應激上調內皮細胞表達TIPE1在H202刺激內皮細胞不同時間后,無論其基因水平還是蛋白水平,H202都能促進TIPE1的表達,呈時間和劑量依賴性。2. TIPE1促進H202誘導的活性氧的產(chǎn)生因文獻報道H202可以直接引起氧化應激并且產(chǎn)生過多的ROS,因此,在TIPE1過表達的情況下,用H202刺激細胞,流式細胞儀檢測細胞內ROS的生成情況以確定TIPE1對H202誘導的ROS產(chǎn)生的影響。結果發(fā)現(xiàn)在沒有H202刺激的情況下,TIPE1本身就可以促進ROS的產(chǎn)生；H202刺激后,TIPE1過表達的細胞內ROS的濃度大幅度提高。3. TIPE1過表達抑制氧化應激時抗氧化酶的表達TIPE1過表達后,H2O2刺激內皮細胞,檢測細胞內過氧化物酶的基因表達情況發(fā)現(xiàn)TIPE1有效的降低了CAT、SOD2、GPx基因的表達,FoxO3a的磷酸化活化水平降低,說明TIPE1過表達抑制氧化應激時抗氧化酶的表達。4. TIPE1抑制內皮細胞生長TIPE1過表達后,CCK-8方法檢測在H202刺激后不同時間其OD的變化情況,發(fā)現(xiàn)TIPE1本身可以抑制細胞生長,而在H202刺激后,TIPE1過表達的細胞其生長增殖速度更低,由此可知,TIPE1在氧化應激時抑制內皮細胞生長。5. TIPE1過表達在氧化應激時促進內皮細胞的死亡5.1臺盼藍染色中TIPE1促進氧化應激誘導的內皮細胞死亡TIPE1過表達后,H202刺激不同時間下用臺盼藍染色發(fā)現(xiàn)TIPE1過表達的細胞其死亡率明顯增加。5.2 Annexin V/PI中TIPE1在氧化應激時促進內皮細胞的凋亡TIPE1過表達后,H202刺激促進了內皮細胞Annexin V與PI雙染所占總細胞的比例,促凋亡分子caspase3的活化及Bax的表達均增高,而抗凋亡蛋白Bc12的顯著降低,細胞周期分析發(fā)現(xiàn),H202刺激促進了內皮細胞PI染色所表示的凋亡峰所占各細胞周期的比例,這些結果提示TIPE1過表達促進氧化應激誘導的內皮細胞死亡。6. TIPE1過表達促進內皮細胞對ox-LDL的攝取在TIPE1過表達的情況下,用ox-LDL刺激內皮細胞,油紅O染色,檢測其ox-LDL吸收情況。發(fā)現(xiàn)TIPE1過表達后促進了內皮細胞對ox-LDL的攝取。7. siRNA沉默TIPE1基因對內皮細胞功能的影響在TIPE1基因沉默情況下,FCM檢測胞內ROS水平明顯低于對照細胞,細胞生長較對照細胞增快,細胞死亡明顯低于轉染對照無關序列的細胞,由此可進一步說明TIPE1能夠促進氧化應激誘導的內皮細胞死亡。8. TIPE1在氧化應激時通過調控Akt、MAPK、IκB信號通路促進內皮細胞的死亡通過western blot檢測H202刺激TIPE1過表達的細胞其Akt、MAPK、IκB信號通路活化情況與對照組比較,可以發(fā)現(xiàn)TIPE1抑制p-Akt、p-IκB、p-Erk的活化而促進P-P38、p-JNK的活化,以此調控在氧化應激時TIPE1所促進的細胞死亡。9. TIPE1蛋白促進ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化的發(fā)生通過對主動脈根部冰凍切片進行油紅O染色及HE染色,以及對腹主動脈進行大體油紅染色,結果發(fā)現(xiàn)注射高效表達TIPE1蛋白的慢病毒的小鼠體內斑塊沉積情況明顯較注射對照慢病毒的小鼠嚴重,TIPE1對小鼠血糖、血清總膽固醇、低密度脂蛋白及高密度脂蛋白的分泌沒有影響,而對甘油三酯和游離脂肪酸的分泌起到促進作用。提示TIPE1可以促進動脈粥樣硬化的發(fā)生。結論1.動物實驗證實TIPE1具有促進動脈粥樣硬化效應；2. TIPE1促動脈粥樣硬化的機制與TIPE1調控血管內皮細胞的氧化應激效應有關,具體表現(xiàn)為：H202誘導內皮細胞氧化應激時上調TIPE1表達,且呈時間和劑量依賴性；表達的TIPE1蛋白抑制內皮細胞的生長,促進氧化應激誘導的內皮細胞死亡,促進內皮細胞對ox-LDL的攝�。�3. TIPE1在氧化應激時通過抑制p-Akt、p-IκB、p-Erk的活化和促進p-P38、p-JNK的活化從而促進內皮細胞死亡；創(chuàng)新點及意義1.首次提出TIPE1促進動脈粥樣硬化形成的創(chuàng)新性論斷；2.首次研究了TIPE1對血管內皮細胞功能的調控作用,提出TIPE1促進氧化應激誘導的細胞凋亡促動脈粥樣硬化形成。
【關鍵詞】：TNFAIP8L1 動脈粥樣硬化 血管內皮細胞 氧化應激 細胞死亡
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R543.5
【目錄】：

• 中文摘要6-11
• 英文摘要11-17
• 符號說明(按字母順序排列)17-19
• 前言19-22
• 實驗材料22-26
• 實驗方法26-39
• 結果39-45
• 討論45-49
• 結論49-50
• 附圖50-62
• 參考文獻62-66
• 致謝66-67
• 攻讀學位期間發(fā)表學術論文目錄67-68
• 附件68

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本文編號：662656