本文關鍵詞：HCMV感染內(nèi)皮細胞來源的外泌體對血管平滑肌細胞功能影響的初步研究

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【摘要】：目的:驗證超速離心法、蔗糖梯度離心法提取HCMV感染的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVEC)上清中外泌體(exosomes)的效率。分析來源于HCMV感染HUVEC來源的exosomes中是否含有差異表達的miRNAs,進一步觀察該exosomes能否與人主動脈平滑肌細胞(human aortic smooth muscle cell,HASMC)通信并影響其遷移功能。方法:(1)選用HCMV-AD169實驗室株及HUVEC原代細胞株,體外模擬HCMV的活動性感染狀態(tài)。實驗共分3組:①實驗組,吸附感染法接種5TCID50活性HCMV-AD169;②陰性對照組,吸附感染法接種等量經(jīng)紫外線(ultraviolet,UV)滅活的HCMV-AD169;③空白對照組,吸附感染法相同步驟模擬接種同等體積DMEM液。當實驗組細胞病變效應(CytopathicEffect,CPE)達到約90%時,3組同時更換培養(yǎng)液,并繼續(xù)培養(yǎng)2～3天后同時收集細胞上清。采用超速離心法及蔗糖梯度離心法提取上清中exosomes。分別以透射電鏡驗證exosomes形態(tài)、直徑,westem-blot驗證exosomes膜表面標志蛋白CD9。(2)EXO-quick試劑盒法提取3組上清中的exosomes,用IlluminaHiSeqTM2500平臺對其miRNAs進行測序,并分析是否具有差異表達的miRNAs。(3)體外培養(yǎng)HASMC,分別與3組離心提取的exosomes共培養(yǎng),以劃痕實驗及transwell實驗檢測exosomes與HASMC的通訊作用及對其遷移能力的影響。結果:(1)超速離心、蔗糖梯度離心所得粒子透射電鏡下檢測顯示,粒子直徑處于30～100 nm間且具有典型"杯托"樣外觀。并且,Western blot檢測證實表達CD9膜蛋白。證實超速離心、蔗糖梯度離心所得粒子即為exosomes。(2)exosomes測序結果顯示:實驗組與空白對照組間共有28對miRNAs表達量差異具有統(tǒng)計學意義,實驗組與陰性對照組間共17對miRNAs表達量差異具有統(tǒng)計學意義,陰性對照組與空白對照組間僅3對miRNAs表達量差異具有統(tǒng)計學意義(fold chang2,p0.05)�；仡櫸墨I發(fā)現(xiàn),部分差異表達miRNAs已被證實可能與心血管疾病有關,如miR-96、miR-3960、miR-221等。(3)與對照組相比,實驗組能顯著促進HASMC的遷移能力,差異具有統(tǒng)計學意義(p0.05);而陰性對照組與空白對照組間差異不具有統(tǒng)計學意義(p0.05)。結論:(1)超速離心及蔗糖離心法能有效提取exosomes。(2)來源于HCMV感染HUVEC的exosomes所含miRNAs存在差異表達。(3)來源于HCMV感染HUVEC的exosomes能與HASMC通信,并促進其遷移功能。
【關鍵詞】：人臍靜脈內(nèi)皮細胞 血管平滑肌細胞 人巨細胞病毒 外泌體 miRNA 超速離心 蔗糖梯度離心
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R54
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 主要英文縮寫表9-10
• 前言10-13
• 材料與方法13-28
• 一、實驗設計13
• 二、主要材料和試劑、儀器13-16
• 三、實驗方法16-27
• 四、統(tǒng)計學方法27-28
• 結果28-41
• 一、細胞模型建立結果28-36
• 二、exosomes鑒定、測序分析結果36-40
• 三、實驗組exosomes促進HASMC遷移功能40-41
• 討論41-45
• 結論45-46
• 參考文獻46-50
• 綜述50-58
• 參考文獻54-58
• 攻讀碩士學位期間已發(fā)表論文58-59
• 致謝59

【參考文獻】

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1 Rosa Sessa;Marisa Di Pietro;Simone Filardo;Ombretta Turriziani;;Infectious burden and atherosclerosis: A clinical issue[J];World Journal of Clinical Cases;2014年07期

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本文編號：655619