本文關(guān)鍵詞：HCMV感染內(nèi)皮細(xì)胞來源的外泌體對血管平滑肌細(xì)胞功能影響的初步研究

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【摘要】：目的:驗(yàn)證超速離心法、蔗糖梯度離心法提取HCMV感染的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVEC)上清中外泌體(exosomes)的效率。分析來源于HCMV感染HUVEC來源的exosomes中是否含有差異表達(dá)的miRNAs,進(jìn)一步觀察該exosomes能否與人主動脈平滑肌細(xì)胞(human aortic smooth muscle cell,HASMC)通信并影響其遷移功能。方法:(1)選用HCMV-AD169實(shí)驗(yàn)室株及HUVEC原代細(xì)胞株,體外模擬HCMV的活動性感染狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)共分3組:①實(shí)驗(yàn)組,吸附感染法接種5TCID50活性HCMV-AD169;②陰性對照組,吸附感染法接種等量經(jīng)紫外線(ultraviolet,UV)滅活的HCMV-AD169;③空白對照組,吸附感染法相同步驟模擬接種同等體積DMEM液。當(dāng)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞病變效應(yīng)(CytopathicEffect,CPE)達(dá)到約90%時,3組同時更換培養(yǎng)液,并繼續(xù)培養(yǎng)2～3天后同時收集細(xì)胞上清。采用超速離心法及蔗糖梯度離心法提取上清中exosomes。分別以透射電鏡驗(yàn)證exosomes形態(tài)、直徑,westem-blot驗(yàn)證exosomes膜表面標(biāo)志蛋白CD9。(2)EXO-quick試劑盒法提取3組上清中的exosomes,用IlluminaHiSeqTM2500平臺對其miRNAs進(jìn)行測序,并分析是否具有差異表達(dá)的miRNAs。(3)體外培養(yǎng)HASMC,分別與3組離心提取的exosomes共培養(yǎng),以劃痕實(shí)驗(yàn)及transwell實(shí)驗(yàn)檢測exosomes與HASMC的通訊作用及對其遷移能力的影響。結(jié)果:(1)超速離心、蔗糖梯度離心所得粒子透射電鏡下檢測顯示,粒子直徑處于30～100 nm間且具有典型"杯托"樣外觀。并且,Western blot檢測證實(shí)表達(dá)CD9膜蛋白。證實(shí)超速離心、蔗糖梯度離心所得粒子即為exosomes。(2)exosomes測序結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)組與空白對照組間共有28對miRNAs表達(dá)量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,實(shí)驗(yàn)組與陰性對照組間共17對miRNAs表達(dá)量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,陰性對照組與空白對照組間僅3對miRNAs表達(dá)量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(fold chang2,p0.05)。回顧文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn),部分差異表達(dá)miRNAs已被證實(shí)可能與心血管疾病有關(guān),如miR-96、miR-3960、miR-221等。(3)與對照組相比,實(shí)驗(yàn)組能顯著促進(jìn)HASMC的遷移能力,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);而陰性對照組與空白對照組間差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。結(jié)論:(1)超速離心及蔗糖離心法能有效提取exosomes。(2)來源于HCMV感染HUVEC的exosomes所含miRNAs存在差異表達(dá)。(3)來源于HCMV感染HUVEC的exosomes能與HASMC通信,并促進(jìn)其遷移功能。
【關(guān)鍵詞】：人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 血管平滑肌細(xì)胞 人巨細(xì)胞病毒 外泌體 miRNA 超速離心 蔗糖梯度離心
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R54
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 主要英文縮寫表9-10
• 前言10-13
• 材料與方法13-28
• 一、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)13
• 二、主要材料和試劑、儀器13-16
• 三、實(shí)驗(yàn)方法16-27
• 四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法27-28
• 結(jié)果28-41
• 一、細(xì)胞模型建立結(jié)果28-36
• 二、exosomes鑒定、測序分析結(jié)果36-40
• 三、實(shí)驗(yàn)組exosomes促進(jìn)HASMC遷移功能40-41
• 討論41-45
• 結(jié)論45-46
• 參考文獻(xiàn)46-50
• 綜述50-58
• 參考文獻(xiàn)54-58
• 攻讀碩士學(xué)位期間已發(fā)表論文58-59
• 致謝59

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 Rosa Sessa;Marisa Di Pietro;Simone Filardo;Ombretta Turriziani;;Infectious burden and atherosclerosis: A clinical issue[J];World Journal of Clinical Cases;2014年07期

2 景錄先;;如何防控心腦血管疾病[J];中國中醫(yī)藥現(xiàn)代遠(yuǎn)程教育;2006年03期

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本文編號：655619