本文關(guān)鍵詞：遺傳性抗凝蛋白缺陷癥致靜脈血栓栓塞癥的分子機(jī)制研究

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【摘要】：第一部分遺傳性抗凝蛋白缺陷癥在VTE人群中的發(fā)病率目的:探討抗凝蛋白缺乏率和遺傳性抗凝蛋白缺陷癥在VTE人群中的發(fā)病率方法:收集277例臨床上急慢性VTE患者的外周血。分別采用凝固法和發(fā)色底物法檢測兩組的抗凝蛋白活性(Antithrombin activity,AT:A;Protein S activity,PS:A;Protein C activity,PC:A)。對抗凝蛋白活性較低者進(jìn)行外周血基因測序分析,發(fā)現(xiàn)對蛋白結(jié)構(gòu)有影響的基因突變。用統(tǒng)計學(xué)方法計算出全部VTE患者中三種抗凝蛋白缺乏率和相應(yīng)的基因缺陷率。結(jié)果:277例VTE病例中發(fā)現(xiàn):AT、PC、PS活性缺乏率分別為16.00%、17.45%、17.09%,遺傳性抗凝蛋白缺陷癥(Antithrombin deficiency,HACPD)發(fā)生率分別為ATD1.5%、PCD6.2%、PSD0.7%。結(jié)論:VTE患者與正常人相比,三種抗凝蛋白活性缺乏率和基因缺陷率都明顯高出10倍以上,說明HACPD是VTE發(fā)病的高危因素。第二部分新雜合點(diǎn)錯義突變致遺傳性抗凝蛋白c缺陷癥的分子機(jī)制研究目的:探討新雜合點(diǎn)突變致遺傳性抗凝蛋白c缺陷癥的分子機(jī)制方法:分析一臨床血栓病例,抽提外周血DNA并做PCR擴(kuò)增及核酸序列分析,構(gòu)建野生型質(zhì)粒(PC wt)和突變型質(zhì)粒(PC-c.1157 TC),將質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染入hek-293t細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行體外表達(dá),rt-PCR觀察突變pc在轉(zhuǎn)錄水平的變化,western blot印跡檢測質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后細(xì)胞裂解液中PC抗原以及細(xì)胞外液分泌的PC含量,細(xì)胞免疫熒光染色檢測PC在細(xì)胞內(nèi)的分布情況。結(jié)果:細(xì)胞免疫熒光驗證質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染入HEK-293T細(xì)胞,rt-pcr:突變型質(zhì)粒的m RNA水平顯著高于野生型;western印跡檢測:PC-c.1157 TC質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞裂解液中PC蛋白和PC wt質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞間沒有顯著性差異,突變型質(zhì)粒蛋白表達(dá)有上調(diào)趨勢;細(xì)胞外液中野生型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞分泌的PC多于突變型,差異有統(tǒng)計學(xué)意義;激光共聚焦示:PC突變體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)的目的蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中聚集明顯增加。結(jié)論:新雜合錯義突變致遺傳性抗凝蛋白C缺陷癥的分子機(jī)制為PC在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)滯留,導(dǎo)致胞外PC分泌量減少,活性降低。第三部分新發(fā)無義突變致抗凝蛋白S缺陷癥的分子機(jī)制研究目的:探討新雜合點(diǎn)突變致遺傳性抗凝蛋白S(Protein S,PS)缺陷癥的分子機(jī)制。方法:分析一臨床血栓病例并做家系調(diào)查,抽提外周血DNA并做PCR擴(kuò)增及核酸序列分析,構(gòu)建野生型質(zhì)粒(PS wt)和突變型質(zhì)粒(PS-c.1771 del A),將質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染hek-293t細(xì)胞,rt-PCR觀察突變PS在轉(zhuǎn)錄水平的變化,western blot檢測質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后細(xì)胞裂解液中PS的表達(dá)量,Elisa檢測觀察質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞外液分泌的PS含量,細(xì)胞免疫熒光染色檢測PS在高爾基體內(nèi)的分布情況。結(jié)果:在PROS1基因上發(fā)現(xiàn)一新發(fā)的無義突變PS-c.1771 del A,家系調(diào)查顯示本研究病例為一遺傳性抗凝蛋白S缺陷癥家系,野生型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞裂解液中m RNA和PS的表達(dá)量顯著高于突變型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞,Elisa檢測到野生型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞外液分泌的PS顯著多于突變型,激光共聚焦也進(jìn)一步顯示突變型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的PS表達(dá)量明顯少于野生型,突變質(zhì)粒內(nèi)的PS在高爾基體內(nèi)的聚集明顯少于野生型質(zhì)粒表達(dá)蛋白。結(jié)論:本病例先證者患遺傳性抗凝蛋白S缺陷癥的分子機(jī)制可能是由于突變導(dǎo)致PS表達(dá)下降、分泌障礙,而后抗凝功能減弱,血栓形成風(fēng)險增加。
【關(guān)鍵詞】：抗凝蛋白 基因缺陷 遺傳性 靜脈血栓 靜脈血栓 錯義突變 抗凝蛋白C 抗凝蛋白C缺陷癥 靜脈血栓 無義突變 抗凝蛋白S 抗凝蛋白s缺陷癥
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R543.6
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• 英文摘要6-9
• 中英文縮略詞對照表9-11
• 緒論11-13
• 第一部分 遺傳性抗凝蛋白缺陷癥在VTE人群中的發(fā)病率13-21
• 對象與方法13-17
• 結(jié)果17-19
• 討論19-21
• 第二部分 新雜合點(diǎn)錯義突變致遺傳性抗凝蛋白c缺陷癥的分子機(jī)制研究21-39
• 對象與方法21-33
• 結(jié)果33-37
• 討論37-39
• 第三部分 新發(fā)無義突變致抗凝蛋白S缺陷癥的分子機(jī)制研究39-58
• 材料與方法39-46
• 實驗結(jié)果46-56
• 討論56-58
• 結(jié)論58-59
• 參考文獻(xiàn)59-64
• 附錄64-65
• 致謝65-67
• 學(xué)術(shù)論文和科研成果目錄67

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本文編號：579496