本文關(guān)鍵詞：hAIF-1重組腺病毒對(duì)A549細(xì)胞增殖和遷移的影響

  更多相關(guān)文章： AIF-1 原核表達(dá) 腺病毒 增殖 遷移 分化

【摘要】：AIF-1是一個(gè)大小為17kDa,位于細(xì)胞質(zhì)中的鈣離子結(jié)合蛋白,包含2個(gè)EF-手形結(jié)構(gòu)域,能夠結(jié)合并聚合肌動(dòng)蛋白,在自然界中AIF-1的豐度不高,所以想要分離得到大量天然的表達(dá)產(chǎn)物困難較大。已有研究證實(shí)AIF-1能夠促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及乳腺癌細(xì)胞等多種細(xì)胞的增殖和遷移,進(jìn)而影響相關(guān)疾病的發(fā)生和發(fā)展,AIF-1與細(xì)胞分化之間關(guān)系的研究較少發(fā)現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)將人AIF-1cDNA克隆到原核表達(dá)載體,并用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),純化AIF-1原核表達(dá)蛋白,初步研究AIF-1對(duì)人肺細(xì)胞株A549增殖和遷移的影響,并首次探討了AIF-1與小鼠成肌細(xì)胞C2C12分化的相關(guān)性。依據(jù)人AIF-1基因序列,設(shè)計(jì)引物,將人AIF-1 cDNA克隆到pET-28a(+)載體,構(gòu)建pET-28a(+)-hAIF-1原核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)菌誘導(dǎo)表達(dá),收集菌體,SDS-PAGE電泳及Western Blot分析蛋白表達(dá)。超聲破碎菌體,分析蛋白的可溶性并純化收集AIF-1蛋白。結(jié)果顯示,pET-28a(+)-hAIF-1質(zhì)粒經(jīng)1：mM IPTG誘導(dǎo)4h后,PAGE電泳檢測(cè)在約20kDa處有一條明顯條帶,說明重組蛋白主要以可溶性形式存在,鎳柱純化后得到純度較高的AIF-1蛋白。構(gòu)建穿梭質(zhì)粒pDC315-EGFP-hAIF-1將穿梭質(zhì)粒與腺病毒骨架質(zhì)粒pBHGloxdeltaE13Cre共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞包裝腺病毒,獲得表達(dá)人AIF-1基因的重組腺病毒,TCID50法測(cè)定病毒滴度,用所制備的重組腺病毒感染A549細(xì)胞,RT-PCR和Western Blot鑒定A549細(xì)胞中AIF-1表達(dá)狀態(tài),MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖,細(xì)胞劃痕和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移。結(jié)果表明,成功構(gòu)建了表達(dá)AIF-1基因的重組腺病毒,所得病毒滴度為2.5×108pfu/ml;用AIF-1重組腺病毒感染人A549細(xì)胞,RT-PCR和Western Blot鑒定顯示細(xì)胞能夠過表達(dá)AIF-1; MTT顯示過表達(dá)AIF-1可顯著增強(qiáng)A549細(xì)胞增殖能力；細(xì)胞劃痕和Tranwell實(shí)驗(yàn)證明過表達(dá)AIF-1能夠促進(jìn)A549細(xì)胞遷移。用2%的馬血清培養(yǎng)基誘導(dǎo)C2C12細(xì)胞分化,以肌球蛋白重鏈(MHC)的表達(dá)作為細(xì)胞分化指標(biāo),Western Blot和Q-PCR檢測(cè)細(xì)胞分化過程中AIF-1的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在誘導(dǎo)第3天MHC開始表達(dá),C2C12細(xì)胞融合形成肌管,之后肌管不斷增加變粗,MHC表達(dá)也逐漸增加,在整個(gè)誘導(dǎo)分化過程中,AIF-1的表達(dá)在蛋白水平上呈上升趨勢(shì),但在mRNA水平上呈下降趨勢(shì),說明C2C12細(xì)胞的分化會(huì)影響AIF-1的表達(dá)。
【關(guān)鍵詞】：AIF-1 原核表達(dá) 腺病毒 增殖 遷移 分化
【學(xué)位授予單位】：南京師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R54
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-6
• 英文縮寫詞表6-9
• 第1章 綜述9-19
• 1.1 同種異體移植物炎癥因子-1(AIF-1)9-13
• 1.1.1 AIF-1的發(fā)現(xiàn)及其類似物9
• 1.1.2 AIF-1基因定位及蛋白特性9-11
• 1.1.3 AIF-1的表達(dá)及主要生物學(xué)功能11-13
• 1.1.3.1 AIF-1的表達(dá)11
• 1.1.3.2 AIF-1與細(xì)胞增殖11-12
• 1.1.3.3 AIF-1與細(xì)胞遷移12-13
• 1.2 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)13
• 1.3 腺病毒載體13-17
• 1.3.1 腺病毒的一般特性13-14
• 1.3.2 腺病毒載體的研究進(jìn)展14-17
• 1.4 C2C12細(xì)胞的分化17
• 1.5 本實(shí)驗(yàn)研究?jī)?nèi)容及意義17-19
• 第2章 hAIF-1基因克隆及原核表達(dá)19-31
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料19-21
• 2.1.1 菌株及質(zhì)粒19
• 2.1.2 主要試劑及耗材19
• 2.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器19-20
• 2.1.4 主要試劑配制20-21
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法21-24
• 2.2.1 hAIF-1基因的克隆(TA克隆)21-22
• 2.2.2 pET-28a(+)-hAIF-1質(zhì)粒構(gòu)建22
• 2.2.3 重組質(zhì)粒的原核表達(dá)及鑒定22-23
• 2.2.4 重組蛋白的可溶性分析和蛋白純化23-24
• 2.2.5 數(shù)據(jù)處理24
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果24-29
• 2.3.1 hAIF-1基因的克隆24-26
• 2.3.2 pET-28a(+)-hAIF-1質(zhì)粒構(gòu)建26-27
• 2.3.3 重組質(zhì)粒的原核表達(dá)及鑒定27-28
• 2.3.4 重組蛋白的可溶性分析和蛋白純化28-29
• 2.4 討論29-31
• 第3章 hAIF-1基因重組腺病毒的構(gòu)建及其對(duì)A549細(xì)胞增殖和遷移的影響31-48
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料31-33
• 3.1.1 菌株、質(zhì)粒及細(xì)胞31
• 3.1.2 主要試劑及耗材31
• 3.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器31-32
• 3.1.4 主要試劑配制32-33
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法33-39
• 3.2.1 E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞的制備33
• 3.2.2 腺病毒穿梭質(zhì)粒pDC315-EGFP-hAIF1的構(gòu)建33-34
• 3.2.3 質(zhì)粒的大量制備34-35
• 3.2.4 重組腺病毒的包裝35-36
• 3.2.5 PCR鑒定重組病毒36
• 3.2.6 重組腺病毒的擴(kuò)增36
• 3.2.7 重組腺病毒滴度的測(cè)定36-37
• 3.2.8 RT-PCR和Western Blot分析hAIF-1在A549細(xì)胞中的表達(dá)37-38
• 3.2.9 腺病毒感染A549細(xì)胞的增殖實(shí)驗(yàn)38-39
• 3.2.10 腺病毒感染A549細(xì)胞的劃痕實(shí)驗(yàn)39
• 3.2.11 腺病毒感染A549細(xì)胞的Transwell實(shí)驗(yàn)39
• 3.2.12 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理39
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果39-45
• 3.3.1 hAIF-1重組腺病毒穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建39-40
• 3.3.2 hAIF-1重組腺病毒的包裝40-41
• 3.3.3 hAIF-1重組腺病毒鑒定41-42
• 3.3.4 hAIF-1重組腺病毒滴度的測(cè)定42
• 3.3.5 RT-PCR和Western Blot分析hAIF-1在A549細(xì)胞中的表達(dá)42
• 3.3.6 hAIF-1重組腺病毒對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響42-43
• 3.3.7 hAIF-1重組腺病毒感染A549細(xì)胞的劃痕實(shí)驗(yàn)43-44
• 3.3.8 hAIF-1重組腺病毒感染A549細(xì)胞的Transwell實(shí)驗(yàn)44-45
• 3.4 討論45-48
• 第4章 AIF-1在C2C12細(xì)胞分化過程中的表達(dá)48-53
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料48
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法48-49
• 4.2.1 小鼠成肌細(xì)胞C2C12分化模型的建立48
• 4.2.2 C2C12細(xì)胞分化過程中AIF-1表達(dá)狀態(tài)分析48-49
• 4.2.3 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理49
• 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果49-51
• 4.3.1 小鼠成肌細(xì)胞C2C12分化模型的建立49-50
• 4.3.2 C2C12細(xì)胞分化過程中AIF-1表達(dá)狀態(tài)分析50-51
• 4.4 討論51-53
• 全文總結(jié)53-54
• 參考文獻(xiàn)54-59
• 致謝59

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本文編號(hào)：550523