發(fā)布時間：2017-07-16 02:00

  本文關(guān)鍵詞：整合素β3胞漿段尾部NITY基序?qū)Ζ立騜β3介導(dǎo)的細(xì)胞功能的影響及機制研究

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【摘要】：整合素αIIbβ3(GPⅡb-Ⅲa)是血小板膜上的主要受體,通過雙向信號轉(zhuǎn)導(dǎo)介導(dǎo)血小板的黏附、伸展和聚集。整合素αIIbβ3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中,β3胞漿段的氨基酸起關(guān)鍵性作用,許多信號分子(如talin,kindlin等)與β3胞漿段特定的氨基酸序列相互作用,調(diào)控整合素αIIbβ3的雙向信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。整合素β3胞漿段尾部NITY基序調(diào)控整合素αIIbβ3相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及機制研究至今尚未完全闡明。本研究體外細(xì)胞模型:利用中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞建立共表達(dá)人類野生型整合素αIIb和野生型β3或突變型β3?NITY(β3胞漿段缺失NITY基序)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株,通過細(xì)胞在固相化纖維蛋白原上的黏附伸展實驗檢測各穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的的黏附及伸展功能,通過免疫共沉淀方法檢測蛋白相互作用。體內(nèi)小鼠模型:利用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的造血干細(xì)胞移植建立空載(vector)、β3野生型和β3?NITY轉(zhuǎn)基因小鼠模型,在血小板上研究整合素β3胞漿段尾部NITY基序?qū)ρ“骞δ艿恼{(diào)控作用。通過轉(zhuǎn)基因血小板與游離的纖維蛋白原的結(jié)合檢測整合素αIIbβ3的內(nèi)向外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能;通過轉(zhuǎn)基因血小板在固相化纖維蛋白原的伸展檢測整合素αIIbβ3的外向內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能。體外實驗結(jié)果表明,成功建立了CHO-αIIbβ3和CHO-αIIbβ3?NITY細(xì)胞株。穩(wěn)定表達(dá)野生型整合素αIIbβ3的CHO細(xì)胞獲得在固相化纖維蛋白原上的黏附和伸展能力,相較于CHO-αIIbβ3細(xì)胞株,CHO-αIIbβ3?NITY細(xì)胞株黏附能力減弱,但是黏附后的伸展能力無明顯改變。免疫共沉淀結(jié)果顯示,kindlin-2能夠結(jié)合野生型整合素β3,但與突變型整合素β3結(jié)合的量顯著減少。而src與野生型整合素β3和突變型整合素β3的結(jié)合無明顯差異。小鼠實驗結(jié)果表明,成功構(gòu)建了vector、β3野生型和β3胞漿段缺失NITY基序的轉(zhuǎn)基因小鼠模型。相較于β3野生型的血小板,β3?NITY的血小板與游離纖維蛋白原的結(jié)合能力減弱,但是在固相化纖維蛋白原上的伸展能力不受影響。結(jié)論:整合素β3胞漿段缺失NITY基序?qū)е抡纤卅罥Ibβ3介導(dǎo)的內(nèi)向外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受到部分損傷,但不影響整合素αIIbβ3介導(dǎo)的外向內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。這種缺失突變導(dǎo)致整合素β3與kindlin蛋白的結(jié)合受到抑制,從而部分抑制了整合素αIIbβ3介導(dǎo)的內(nèi)向外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。
【關(guān)鍵詞】：整合素αIIbβ3 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株 kindlin-2蛋白 造血干細(xì)胞移植 逆轉(zhuǎn)錄病毒 雙向信號轉(zhuǎn)導(dǎo)
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R543
【目錄】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-10
• 符號說明10-13
• 前言13-22
• 實驗材料與方法22-38
• 1. 實驗材料22-23
• 1.1 質(zhì)粒和細(xì)胞株22
• 1.2 主要試劑22-23
• 1.3 主要耗材23
• 1.4 實驗動物23
• 2. 實驗方法23-38
• 2.1 構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株23-26
• 2.1.1 構(gòu)建編碼突變型人整合素 β3 的真核表達(dá)載體23
• 2.1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的建立23-24
• 2.1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株中 β3 和 αIIb的表達(dá)24
• 2.1.4 蛋白印跡法（Western blot）檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株中整合素 αIIb和 β3 蛋白的表達(dá)24-26
• 2.2 細(xì)胞在固相化纖維蛋白原上的黏附及伸展試驗26
• 2.3 蛋白免疫共沉淀（Co-IP）檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株胞內(nèi)的蛋白質(zhì)相互作用26-28
• 2.3.1 Co-IP檢測 β3 與kindlin蛋白之間的相互作用27
• 2.3.2 Co-IP檢測 β3 與src之間的相互作用27-28
• 2.4 純合子小鼠繁殖與鑒定28-30
• 2.4.1 純合子小鼠繁殖28
• 2.4.2 純合子小鼠的基因型鑒定28-30
• 2.5 逆轉(zhuǎn)錄病毒的獲得30-33
• 2.5.1 病毒質(zhì)粒的抽提及測序30-31
• 2.5.2 逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝及感染效率測定31-33
• 2.6 小鼠造血干細(xì)胞移植33-35
• 2.6.1 移植前準(zhǔn)備33-34
• 2.6.2 骨髓移植34-35
• 2.7 流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)基因小鼠血小板的 β3 及GFP的表達(dá)35
• 2.8 轉(zhuǎn)基因血小板的功能分析35-37
• 2.8.1 流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)基因小鼠血小板與游離纖維蛋白原的結(jié)合35-36
• 2.8.2 轉(zhuǎn)基因小鼠血小板在固相化纖維蛋白原的伸展36-37
• 2.9 統(tǒng)計學(xué)分析37-38
• 實驗結(jié)果38-54
• 1. 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的建立38-40
• 1.1 β3 突變型（β3?NITY）真核表達(dá)載體的構(gòu)建38-39
• 1.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株中 αIIb和 β3 的表達(dá)39
• 1.3 免疫印跡法檢測蛋白的表達(dá)39-40
• 2. 細(xì)胞在固相化纖維蛋白原上的黏附及伸展情況40-42
• 3. Co-IP檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株胞內(nèi)的蛋白質(zhì)相互作用42-43
• 3.1 Co-IP檢測 β3 與kindlin蛋白之間的相互作用42
• 3.2 Co-IP檢測 β3 與src之間的相互作用42-43
• 4. 逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的造血干細(xì)胞移植方法的評估43-45
• 5. 純合子小鼠的基因型鑒定45
• 6. 空載、野生型及突變型整合素 β3 逆轉(zhuǎn)錄病毒的獲得45-48
• 6.1 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的測序鑒定45-46
• 6.2 逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝46-47
• 6.3 逆轉(zhuǎn)錄病毒感染效率測定47-48
• 7. 轉(zhuǎn)基因小鼠血小板的 β3 及GFP的表達(dá)48-50
• 8. 轉(zhuǎn)基因小鼠血小板與游離纖維蛋白原的結(jié)合50-51
• 9. 轉(zhuǎn)基因小鼠血小板在固相化纖維蛋白原上的伸展51-54
• 討論54-59
• 結(jié)論59-60
• 參考文獻(xiàn)60-63
• 致謝63-64
• 附錄64

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本文編號：546594