本文關鍵詞：RNA干擾對大鼠血管平滑肌細胞Ca_v1.2、Ca_v1.3基因表達的影響

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【摘要】：血管平滑肌細胞主要存在于血管中模內(nèi),它是構成血管中膜的物質基礎,發(fā)揮著一定的生理功能,對調節(jié)血管壁的舒張性及維持血管壁的完整性有著重要的作用。近年來研究發(fā)現(xiàn),隨著大氣污染加劇,心血管病頻頻出現(xiàn)。其病理學分子機制是近年來血管增殖性疾病研究及防治熱點、難點。因此掌握一種高效、簡單的血管平滑肌細胞培養(yǎng)方法是很有必要的。RNA干擾是近幾年來新發(fā)展的一種基因阻斷技術,是一種可以使mRNA發(fā)生特異性降解的轉錄后基因沉默現(xiàn)象。它已成為抗腫瘤、抗病毒、調控基因表達、基因治療、研究基因功能等領域的一個重要研究方向及熱點。研究表明,L-Ca2+α1亞基在血管平滑肌細胞中起著很重要的作用。大鼠主動脈平滑肌上L-Ca2+ αl亞基主要受Cav1.2和Cav1.3編碼影響。本課題采用組織塊貼壁法培養(yǎng)原代大鼠血管平滑肌細胞,然后傳至5-8代,用構建的靶向Cav1.2、Cav1.3基因siRNA載體轉染大鼠血管平滑肌細胞,特異性沉默大鼠胸主動脈平滑肌細胞Cav1.2、Cav1.3基因的表達。用MTT法檢測siRNA干擾對大鼠血管平滑肌細胞活性的影響。再用熒光實時定量RT-PCR和Western-Blot等分子生物學技術檢測Cav1.2、Cav1.3 mRNA平及其蛋白質表達水平,從生物大分子水平證明RNA干擾對這兩種基因的抑制效應。結果顯示,轉染24 h后,即出現(xiàn)轉染陽性細胞,48 h后,觀察發(fā)現(xiàn)熒光強度進一步增強。經(jīng)計算得出轉染效率大于70%。轉染72 h后,收集細胞,提取mRNA進行PCR測定后,結果可見陰性對照組與空白對照組相比較,Cav1.2、Cav1.3　mRNA表達水平差異無顯著性意義(P0.05),實驗組的Cav1.2與Cav1.3 mRNA表達水平顯著低于空白對照組,分別比空白組下降86.54%、88.38%(P0.01)。轉染72h后,收集細胞,提取蛋白進行Western-Blot檢測后,觀察條帶可見,空白對照組與陰性對照組的Cav1.2、Cav1.3蛋白雜交帶亮度明顯強于基因組,分析結果可見陰性對照組與空白對照組相比較,Cav1.2、Cav1.3蛋白表達水平差異無顯著性意義(P0.05),實驗組的Cav1.2與Cav1.3蛋白表達量比空白組分別下降80.36%、82.69%(P0.05)。結果表明轉染siRNA的表達載體可明顯抑制大鼠血管平滑肌細胞Cav1.2、Cav1.3基因在轉錄和翻譯水平上的表達,基因組Cav1.2、Cav1.3的RNA的表達和蛋白表達較陰性對照組和空白對照組明顯受到抑制。此方法可為探索血管致病基因及發(fā)病機制等提供重要的科學依據(jù)及參考。
【關鍵詞】：RNA干擾 大鼠 血管平滑肌細胞 Ca_v1.2 Ca_v1.3 MTT
【學位授予單位】：山西大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：X51;R54
【目錄】：

• 中文摘要8-10
• Abstract10-12
• 第一章 文獻綜述12-22
• 1.1 血管平滑肌細胞的研究進展及培養(yǎng)12-15
• 1.2 RNA干擾15-19
• 1.3 選題背景、研究內(nèi)容及意義19-22
• 1.3.1 選題背景19
• 1.3.2 研究內(nèi)容19-20
• 1.3.3 研究課題意義20-22
• 第二章 大鼠血管平滑肌細胞的培養(yǎng)22-26
• 2.1 前言22
• 2.2 材料與方法22
• 2.2.1 試驗用材22
• 2.2.2 主要試劑22
• 2.3 方法22-24
• 2.3.1 大鼠血管平滑肌細胞培養(yǎng)22-23
• 2.3.2 細胞傳代23-24
• 2.4 討論24-26
• 第三章 RNA干擾大鼠血管平滑肌細胞Ca_v1.2、Ca_v1.3基因26-32
• 3.1 引言26
• 3.2 材料26
• 3.2.1 試驗用材26
• 3.2.2 主要試劑26
• 3.3 方法26-29
• 3.3.1 shRNA的合成26-27
• 3.3.2 MTT法測定轉染后大鼠血管平滑肌細胞的存活率27-28
• 3.3.3 shRNA轉染細胞28-29
• 3.4 結果29-30
• 3.5 討論30-32
• 第四章 RT-PCR法及Western-Blot檢測Ca_v1.2、Ca_v1.3mRNA和蛋白的表達32-38
• 4.1 材料與試劑32
• 4.2 方法32-34
• 4.2.1 細胞RNA提取及含量測定32
• 4.2.2 cDNA合成32-33
• 4.2.3 熒光實時定量PCR33
• 4.2.4 總蛋白提取33
• 4.2.5 Western-Blot檢測蛋白的表達33-34
• 4.2.6 統(tǒng)計處理34
• 4.3 結果34-36
• 4.3.1 RNA干擾后對血管平滑肌細胞Ca_v1.2、Ca_v1.3 mRNA表達的影響34-35
• 4.3.2 血管平滑肌細胞Ca_v1.2、Ca_v1.3蛋白表達的變化35-36
• 4.4 討論36-38
• 第五章 結論38-39
• 參考文獻39-45
• 攻讀學位期間取得的研究成果45-46
• 致謝46-47
• 個人簡況及聯(lián)系方式47-48
• 承諾書48-49

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 李悅梅,馮大明,萬載陽,王雙,沈丹彤,趙桂玲,楊永宗;組織塊法培養(yǎng)大鼠腸系膜小動脈的平滑肌細胞[J];南華大學學報(醫(yī)學版);2003年03期

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本文編號：536621