本文關鍵詞：JNK通路介導LPS誘導臍靜脈內皮細胞PD-L1表達的實驗研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景 冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(冠心病)已經成為威脅人類健康的三大殺手之一,也是影響人們生活質量的最常見、嚴重的心血管疾病之一。研究表明,動脈粥樣硬化是一種炎癥性疾病,在動脈粥樣斑塊內有大量的巨噬細胞、單核細胞、T淋巴細胞和樹突狀細胞等炎癥細胞的浸潤,斑塊內炎癥反應非常明顯；在冠心病的發(fā)生發(fā)展過程中,不論是從脂質條紋到粥樣斑塊或纖維斑塊,還是不穩(wěn)定斑塊的生成、破裂、血栓形成,始終都有各種炎癥細胞的參與。由此可見,抑制炎癥細胞活性,通過免疫調節(jié)阻斷炎癥反應通路已成為研究及治療冠心病的熱點和難點。眾所周知,炎癥反應的活化與T淋巴細胞明顯相關,而近年研究表明,負性刺激信號(PD-1/PD-L1)對T淋巴細胞活化起重要作用。 JNK又稱c-Jun N-末端激酶或者應激活化的蛋白激酶(stress activiated protein kinase, SAPK),是促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)超家族成員之一,是一類絲氨酸/蘇氨酸激酶,位于細胞胞質之中,相對分子量為46×103和54×103,存在特定的功能區(qū)(Thr-Pro-Tyr),其編碼基因為JNK1、JNK2和JNK3,其中JNK1和JNK2存在于全身各組織中,而JNK3主要存在于腦、心臟和睪丸等組織。JNK的活化是通過氨基末端殘基磷酸化實現(xiàn)的,而JNK的激活可以受多種細胞外因素的刺激而啟動,包括生長因子、細胞因子(IFN-γ、IL-1、TNF-α等)、應激刺激(紫外線、細胞高滲透壓、缺血再灌注損傷)等。一旦JNK激活,JNK將由細胞質轉入細胞核中,廣泛參與細胞凋亡、增殖、代謝及DNA損傷修復等多種生物學反應,而其功能的失調可造成神經退行性病變、缺血再灌注損傷、糖尿病和腫瘤等多種疾病。 程序性死亡因子配體1(programmed cell death ligand1, B7-H1、CD274或PD-L1)是由290個氨基酸構成的Ⅰ型跨膜蛋白。PD-L1是B7家族分子的重要成員,它的受體既不是CTLA-4蛋白(cytotoxic T-lymphocyte Antigen4, CTLA-4),也不是ICOS蛋白(inducible co-stimulator, ICOS)和CD28蛋白,其受體為程序性死亡因子1(programmed cell death1receptor,CD279或PD-1)。在最初的研究中發(fā)現(xiàn),PD-L1在腫瘤細胞中有高表達,因此,人們推測PD-L1可能與腫瘤細胞浸潤有關；但近年研究表明,除腫瘤細胞以外,PD-L1在許多炎癥細胞上均有表達,如T淋巴細胞、B淋巴細胞、Kupffer細胞、巨噬細胞、星形細胞、血管內皮細胞、樹突狀細胞、胎盤合體滋養(yǎng)層細胞等等；PD-L1的功能除與腫瘤細胞浸潤明顯相關以外,還與多種疾病發(fā)生有密切的關系,如移植免疫反應、微生物感染(病毒感染)、自身免疫性疾病,近年來研究還發(fā)現(xiàn)與動脈粥樣斑塊形成也明顯有關。Gotsman等用熒光免疫技術研究冠狀動脈時發(fā)現(xiàn),PD-L1表達于多處動脈粥樣斑塊內。Lee等研究也發(fā)現(xiàn),冠心病患者較正常人相比,T淋巴細胞及樹突狀細胞PD-1/PD-L1表達均顯著降低,而T淋巴細胞增殖能力卻增強,證實PD-L1/PD-1與致動脈粥樣硬化性T淋巴細胞免疫調節(jié)有著密切聯(lián)系,能夠負性信號調控冠狀動脈粥樣斑塊形成,在冠心病的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。雖然現(xiàn)在對PD-Ll的功能有了一定了解,但對于PD-1/PD-L1細胞內信號通路的轉導機制目前尚不明了。不同研究對象及使用不同刺激物所得出結果不完全相同,總的來說,影響PD-L1表達的細胞信號通路可能為PI3K/Akt信號通路、JAK/STAT信號通路、NPM/ALK通路、MEK/Erk信號通路,以及與STAT-3和IRF-1轉錄因子有關。眾所周知,JNK信號通路是MAPK通路的重要分支,它能通過細胞外刺激誘導多種細胞凋亡的發(fā)生。然而關于PD-L1蛋白表達與JNK信號通路的關系的研究資料甚少。 鑒于以上證據(jù),本課題以體外培養(yǎng)臍靜脈內皮細胞作為研究對象,利用炎癥因子(LPS)刺激臍靜脈內皮細胞模擬病原微生物入侵的模型,觀察臍靜脈內皮細胞PD-L1表型的變化；再以JNK蛋白特異性抑制劑SP600125阻斷JNK通路,探討臍靜脈內皮細胞表達PD-L1與JNK信號通路的關系,闡明LPS誘導臍靜脈內皮細胞表達PD-L1蛋白的分子機制,完善負性協(xié)同刺激信號(PD-1、PD-L)調控T淋巴細胞活性的機理,有望為動脈粥樣硬化的免疫治療的提供新的思路及理論基礎。 目的 1.LPS能否誘導臍靜脈內皮細胞表達PD-L1。 2.以JNK蛋白特異性抑制劑SP600125阻斷JNK信號通路后,觀察樹突狀細胞受炎癥因子刺激后PD-L1表型變化,探討樹突狀細胞表達PD-L1與JNK信號通路的關系。 對象和方法 1、對象 體外培人臍靜脈內皮細胞。 2、方法 2、1臍靜脈內皮細胞的分離、鑒定及傳代培養(yǎng) 無菌條件下,取健康產婦剖腹產后新鮮的胎兒臍帶,磷酸緩沖鹽溶液(PBS)緩沖液清洗,用I型膠原酶消化、離心,加入含20%胎牛血清的M199培養(yǎng)液,放入5%C02培養(yǎng)箱內中37℃培養(yǎng)。24h后換液,待細胞生長達鋪滿瓶底80%-90%,以0.125%胰蛋白酶消化后傳代培養(yǎng),并在倒置顯微鏡下觀察細胞的形態(tài),選擇生長良好的第4～5代細胞用于實驗。采用形態(tài)學和內皮細胞Ⅷ相關抗原進行鑒定。 原代的細胞一般培養(yǎng)4-5天后細胞可長滿培養(yǎng)瓶底95%以上,顯微鏡下觀察細胞融合成單層呈鋪路石狀,此時可傳代。棄去培養(yǎng)瓶中舊培養(yǎng)液,用PBS(37℃預熱20分鐘)洗滌2-3次,加入1ml0.125%的胰蛋白酶(37℃預熱20分鐘)室溫消化細胞20s,顯微鏡下觀察細胞皺縮變圓、彼此分離即可將胰蛋白酶吸出,然后加入M199完全培養(yǎng)液終止消化,吸管輕柔吹打至均勻細胞懸液,按1：2傳代培養(yǎng)。 2.2程序降溫法凍存內皮細胞,快速融化法復蘇細胞 2.2.1內皮細胞的凍存 用一次性吸管吸去培養(yǎng)瓶中廢棄的培養(yǎng)液,再用PBS洗滌細胞2次。以0.125%胰酶消化20秒,顯微鏡下觀察細胞變圓、皺縮。用一次性吸管吸出胰酶,凍存液加入培養(yǎng)瓶中終止消化。彎頭吸管吹打瓶中細胞數(shù)分鐘,顯微鏡下觀察細胞全部脫落。再將細胞懸液加入凍存管中,標記日期、細胞種類,封口膠封口。 細胞程序降溫：4℃冰箱20分鐘→-20℃冰箱1小時→-70℃冰箱過夜→次晨投入液氮罐。 2.2.2內皮細胞的復蘇 用鑷子從液氮罐中取出標記內皮細胞的凍存管,將其迅速放入37℃水浴箱中充分搖晃至凍存管中細胞完全解凍(大約1分鐘)。用酒精擦拭凍存管后入超凈工作臺。在15m1離心管中預先加入3倍凍存細胞體積的M199完全培養(yǎng)基,用一次性吸管將細胞液吸出加入離心管中混勻。低速離心：300rpm離心5分鐘或500rpm離心3分鐘。去上清,加培養(yǎng)液培養(yǎng)。將培養(yǎng)瓶置入孵箱中培養(yǎng),待細胞長滿后進行傳代。 2.3實驗分組(每組設3個復孔,重復實驗4次) 收獲第五代臍靜脈內皮細胞,調整細胞密度為2×107/ml,接種于6孔培養(yǎng)板中。根據(jù)是否使用LPS和JNK蛋白特異性抑制劑SP600125將實驗分成三組：陰性對照組、LPS組和SP600125+LPS組(LPS及SB203580均用二甲基亞砜(DMSO)溶解) 第一組為陰性對照組(NORMAL):將未加入任何藥物的細胞繼續(xù)培養(yǎng)24小時作為陰性對照。 第二組為LPS刺激組(LPS)：首先在實驗細胞中加入DMSO (0.1%V/V)作用1小時,再加入LPS (1.0μg/ml)繼續(xù)培養(yǎng)24小時(LPS每12h半量換液)； 第三組為SP600125+LPS共刺激組：首先在實驗細胞中加入SP600125(20μmol/L)作用1h后再用LPS刺激24h(LPS每12h半量換液)。 2.4Western blot檢測PD-L1蛋白 自6孔培養(yǎng)板中提取人臍靜脈內皮細胞,用RIPA細胞裂解液抽提全細胞蛋白樣品,并經BCA法測定蛋白質濃度,SDS-PAGE電泳分離蛋白后轉移到PVDF膜上,5%的脫脂奶粉封閉2h,加入抗PD-L1多克隆抗體,4℃孵育過夜,PBS洗膜后加入二抗,37℃孵育2h后ECL發(fā)光,暗室中曝光、顯影、定影。Quantity One凝膠軟件分析系統(tǒng)分析蛋白條帶的光密度值。 2.5Western blot檢測P-JNK、JNK蛋白 自6孔培養(yǎng)板中提取人臍靜脈內皮細胞,用RIPA細胞裂解液抽提全細胞蛋白樣品,并經BCA法測定蛋白質濃度,SDS-PAGE電泳分離蛋白后轉移到PVDF膜上,5%的脫脂奶粉封閉2h,加入抗p-JNK多克隆抗體和抗JNK多克隆抗體,4℃孵育過夜,PBS洗膜后加入.抗,37℃孵育2h后ECL發(fā)光,暗室中曝光、顯影、定影。Quantity One凝膠軟件分析系統(tǒng)分析蛋白條帶的光密度值,以p-JNK/JNK蛋白光密度的比值代表p-JNK的光密度值,分別算出陰性對照組、LPS組、SP600125+LPS組光密度的比值。 3.統(tǒng)計學方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件處理,計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(x±S)表示,統(tǒng)計學分析多樣本比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),多重比較采用SNK-q檢驗,P0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。 4.結果 4.1MTT檢測HUVECs增殖 各組臍靜脈內皮細胞OD值測定。陰性對照組OD值為0.32±0.003,LPS組0D值為0.34±0.033,SP600125+LPS組OD值為0.31±0.018,各組OD值比較P0.05,各組細胞增殖無顯著差異。 4.2Western blot檢測PD-L1蛋白 Western blot曝光灰度掃描結果(Z值)顯示,LPS組為1.12±0.72,SP600125+LPS組為0.66±0.36,對照組為0.59±0.30。SP600125+LPS組與對照組Z值均小于LPS組(P0.05或P0.05),SP600125+LPS組Z值與陰性對照組無顯著差異(P0.05)。 4.3Western blot檢測JNK、P-JNK蛋白 Western blot曝光灰度掃描結果(Z值)顯示,LPS組為1.26±0.09,SP600125+LPS組為0.49±0.18,對照組為0.95±0.21。SP600125+LPS組Z值均小于其它2組(P0.05或P0.05),LPS組Z值顯著大于對照組(P0.05)。 5結論 1、LPS可以誘導臍靜脈內皮細胞PD-L1表達增高； 2、JNK信號通路可能參與調控臍靜脈內皮細胞表達PD-L1。
【關鍵詞】：程序性死亡因子配體1 JNK信號通路 SP600125 臍靜脈內皮細胞
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R541.4
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-17
• 前言17-20
• 第一章 人臍靜脈內皮細胞的體外培養(yǎng)與鑒定20-30
• 1 材料和方法20-25
• 2 結果25-26
• 3 討論26-29
• 4 結論29-30
• 第二章 JNK通路介導LPS誘導臍靜脈內皮細胞PD-L1表達的實驗研究30-48
• 1 材料和方法30-34
• 2 實驗方法34-41
• 3 結果41-43
• 4 討論43-48
• 參考文獻48-54
• 中英文縮略詞對照表54-55
• 綜述55-64
• 參考文獻61-64
• 攻讀學位期間成果64-65
• 致謝65-67

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