目的:探討內皮細胞Yes相關蛋白(YAP)在小鼠下肢缺血后動脈生成過程中的作用與機制。方法:缺氧處理人臍靜脈內皮細胞(HUVECs),并使用Western blot檢測YAP第127位絲氨酸的磷酸化水平,采用免疫熒光染色檢測YAP的細胞亞定位情況;免疫共沉淀實驗檢測HUVECs中YAP與缺氧誘導因子1α(HIF-1α)結合的情況;螢光素酶報告基因實驗檢測YAP野生型(YAP-WT)質粒以及YAP絲氨酸位點突變(YAP-5SA)質粒對HIF-1α轉錄活性的調節(jié);構建內皮細胞特異性YAP過表達(EC-YAPtg)小鼠,于結扎股動脈手術后1、8、15和22 d使用激光多普勒血流儀檢測小鼠下肢血流恢復情況;免疫熒光染色檢測小鼠腓腸肌CD31、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)及巨噬細胞分化抗原3(Mac3)的表達情況。結果:缺氧可以時間依賴性地下調YAP第127位絲氨酸的磷酸化,同時促進YAP在細胞核定位;免疫共沉淀實驗證實,YAP可以與HIF-1α在缺氧條件下相互結合;YAP-WT或者YAP-5SA均可以顯著增加HIF-1α的轉錄活性;與對照(YAPflox)小鼠相比,EC-YAPtg小鼠下肢...

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圖1 缺氧降低YAP蛋白磷酸化水平并增加其核轉位

EC-YAPtg小鼠的構建過程如圖4A所示。對EC-YAPTg小鼠和對照小鼠（YAPflox）行股動脈結扎手術，分別于術后1、8、15和22d使用激光多普勒血流儀檢測小鼠下肢血流恢復情況。與YAPflox小鼠相比，EC-YAPtg小鼠下肢的血流灌注顯著增加（P<0.05），見圖....

圖2 YAP蛋白和HIF-1α蛋白相互結合

進一步提取EC-YAPtg小鼠和YAPflox小鼠腓腸肌并且進行免疫細胞化學染色檢測CD31、α-SMA及Mac3表達水平。相比于YAPflox小鼠，EC-YAPtg小鼠肌肉中CD31和α-SMA表達明顯增高（P<0.05），而Mac3表達沒有明顯變化（P>0.05），見圖5。這....

圖3 YAP增加HIF-1α的轉錄活性

圖2YAP蛋白和HIF-1α蛋白相互結合討論

圖4 YAP過表達可以促進下肢缺血后血流恢復

血管生成，即從已有血管網(wǎng)中形成新的血管，常見于發(fā)育過程中[16]；動脈生成，是指現(xiàn)有的側支血管的擴張，內皮細胞增殖后，平滑肌細胞有絲分裂，彈性層內破裂，血管平滑肌細胞遷移形成新內膜，一般見于出生后動脈網(wǎng)的延伸或缺血損傷后天然微血管側支小動脈轉變?yōu)楣δ軇用}等過程[17]。動脈生成與....

本文編號：4016031