目的:急性心肌梗死是心血管疾病死亡的重要原因之一,再灌注治療是對其最好的治療方法。即使許多再灌注的患者血液供應(yīng)得到了恢復(fù),但是心肌組織依然出現(xiàn)了損傷的進(jìn)行性加重,這種損傷被稱為缺血再灌注損傷。在缺血再灌注損傷諸多因素中,活性氧累積的氧化應(yīng)激損傷是其核心。因此,通過對氧化應(yīng)激損傷調(diào)控機(jī)制的探索,可以為治療缺血再灌注損傷及其他氧化應(yīng)激引起的心血管疾病提供新的策略。近年來,許多研究證實(shí)了泛素-蛋白酶體系統(tǒng),尤其是E3泛素化連接酶在氧化應(yīng)激損傷的調(diào)控中起到關(guān)鍵的作用,cul4a是近期發(fā)現(xiàn)的一種E3泛素化連接酶,與癌癥有著密切的聯(lián)系,廣泛參與了細(xì)胞生理和病理過程。但是,目前尚沒有研究表明cul4a是否參與到心血管系統(tǒng)疾病中,發(fā)揮怎樣的生理功能和病理作用。因此,本研究擬應(yīng)用體外心肌細(xì)胞實(shí)驗(yàn),探討cul4a在心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷中的作用及分子機(jī)制。研究方法:選擇H₂O₂作為H9c2心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的誘導(dǎo)因素,首先用50μM、100μM、200μM、400μM的H₂O₂處理2小時(shí)后,利用CCK-8-kit測定其...

【文章頁數(shù)】：73 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮略語
1 前言
2 材料與方法
    2.1 材料與試劑
        2.1.1 細(xì)胞系
        2.1.2 抗體
        2.1.3 培養(yǎng)基、檢測試劑盒和相關(guān)主要試劑
        2.1.4 實(shí)驗(yàn)溶液
        2.1.5 siRNA序列
        2.1.6 耗材
        2.1.7 主要儀器設(shè)備
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.2.2 siRNA的構(gòu)建
        2.2.3 H9c2細(xì)胞的復(fù)蘇、傳代培養(yǎng)、凍存
        2.2.4 H9c2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的誘導(dǎo)
        2.2.5 H9c2 細(xì)胞系敲減cul4a
        2.2.6 H9c2 細(xì)胞中過表達(dá)cul4a
        2.2.7 細(xì)胞活力測定
        2.2.8 細(xì)胞免疫熒光
        2.2.9 AnnexinⅤ-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞凋亡
        2.2.10 Western Blot檢測蛋白的表達(dá)量
        2.2.11 免疫共沉淀
        2.2.12 ROS熒光
        2.2.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
3 結(jié)果
    3.1 心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷上調(diào)cul4a表達(dá)
    3.2 cul4a對 H₂O₂ 誘導(dǎo)的H9c2 心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的影響
        3.2.1 H9c2 心肌細(xì)胞過表達(dá)cul4a減輕H₂O₂ 誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷
        3.2.2 H9c2 心肌細(xì)胞敲減cul4a加重H₂O₂ 誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷
    3.3 cul4a的表達(dá)影響H₂O₂ 誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷中ROS的變化
        3.3.1 H9c2 細(xì)胞內(nèi)ROS水平隨H₂O₂ 誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷程度加重而上升
        3.3.2 H9c2 心肌細(xì)胞過表達(dá)cul4a降低H₂O₂ 誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷中ROS的水平
        3.3.3 H9c2 心肌細(xì)胞敲減cul4a增加H₂O₂ 誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷中ROS的水平
    3.4 H9c2 心肌細(xì)胞中cul4a與凋亡相關(guān)蛋白PARP-1 的相互作用
        3.4.1 免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)確定PARP-1 作為E3 泛素化連接酶cul4a全新的結(jié)合蛋白與其相互作用
        3.4.2 在H₂O₂ 誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷中,cul4a與 PARP-1 相互作用增強(qiáng)
    3.5 cul4a作為E3 泛素化連接酶可以降解PARP-1,減少其表達(dá)
        3.5.1 梯度過表達(dá)cul4a可以使PARP-1 表達(dá)水平逐漸降低
        3.5.2 敲減cul4a程度與PARP-1 表達(dá)水平增加正相關(guān)
4 討論
5 結(jié)論
本研究創(chuàng)新性的自我評價(jià)
參考文獻(xiàn)
綜述
    參考文獻(xiàn)
攻讀學(xué)位期間取得的研究成果
致謝
個(gè)人簡歷



本文編號(hào)：3933068