研究背景及目的:我國(guó)心血管疾病高居致死病因首位,且持續(xù)上升。心肌梗死可以造成心肌細(xì)胞不可逆的損傷和丟失,且現(xiàn)有的手段難以逆轉(zhuǎn)心梗后心肌衰竭的進(jìn)程。如何減少心梗后心肌細(xì)胞丟失、促進(jìn)功能重建是心血管研究領(lǐng)域的重大問題。由于人多能干細(xì)胞可在體外無(wú)限增殖,并可分化為各種心血管細(xì)胞,移植干細(xì)胞及衍生細(xì)胞為心梗后心肌修復(fù)帶來(lái)希望。人胚胎干細(xì)胞衍生心血管前體細(xì)胞具有顯著的治療心肌梗死的療效。本研究的目的是驗(yàn)證胚胎干細(xì)胞衍生心血管前體細(xì)胞的治療有效性和安全性,同時(shí)探索不同免疫抑制劑方案對(duì)人多能干細(xì)胞大動(dòng)物研究的效果。我們?cè)谑褂昧瞬煌庖咭种苿┑姆侨遂`長(zhǎng)類動(dòng)物中建立心梗模型,并在心梗后將人胚胎干細(xì)胞來(lái)源心血管前體細(xì)胞移植進(jìn)入動(dòng)物心臟中,通過多種評(píng)價(jià)方法,對(duì)其治療作用與潛在機(jī)制做進(jìn)一步研究。方法和結(jié)果:我們利用之前建立的方法,運(yùn)用單層分化方法,成功將人胚胎干細(xì)胞高效地誘導(dǎo)為心血管前體細(xì)胞。在使用了環(huán)孢霉素(cyclosporine)和聯(lián)合使用環(huán)孢霉素,甲強(qiáng)龍和舒萊(MDR)的食蟹猴中構(gòu)建了心梗模型,在心梗后30min后,將107人胚胎干細(xì)胞衍生心血管前體細(xì)胞心肌內(nèi)注射進(jìn)入不同食蟹猴梗死周邊區(qū)。同時(shí),本研究...

【文章頁(yè)數(shù)】：107 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
致謝
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英文摘要
縮略詞表
1 引言
2 實(shí)驗(yàn)材料
    2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
    2.2 實(shí)驗(yàn)儀器
    2.3 實(shí)驗(yàn)試劑
    2.4 細(xì)胞培養(yǎng)試劑
3 實(shí)驗(yàn)方法
    3.1 細(xì)胞培養(yǎng)
        3.1.1 人胚胎干細(xì)胞hESC的復(fù)蘇
        3.1.2 人胚胎干細(xì)胞hESC的培養(yǎng)
        3.1.3 人胚胎干細(xì)胞hESC的傳代
        3.1.4 人胚胎干細(xì)胞hESC的凍存
        3.1.5 人胚胎干細(xì)胞堿性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,ALP)活性的鑒定
        3.1.6 表達(dá)EGFP的人胚胎干細(xì)胞hESC建立
    3.2 人胚胎干細(xì)胞向心血管前體細(xì)胞(cardiovascular progenitor cells,CVPCs)分化
    3.3 流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞
    3.4 人胚胎干細(xì)胞hESC和心血管前體細(xì)胞(CVPC)的免疫熒光染色
    3.5 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
        3.5.1 食蟹猴的免疫抑制劑方案
        3.5.2 食蟹猴心梗手術(shù)與細(xì)胞移植
        3.5.3 食蟹猴心臟超聲檢測(cè)
        3.5.4 食蟹猴的血常規(guī)和肝腎功能檢測(cè)
        3.5.5 食蟹猴的處死與組織留存
    3.6 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)
        3.6.1 基因組DNA的提取
        3.6.2 熒光定量PCR
    3.7 Western Blot
        3.7.1 總蛋白提取
        3.7.2 總蛋白定量
        3.7.3 SDS-PAGE凝膠電泳
        3.7.4 轉(zhuǎn)膜(濕法)
        3.7.5 封閉,抗體結(jié)合和顯影
    3.8 組織學(xué)檢測(cè)
        3.8.1 組織樣品冰凍切片
        3.8.2 免疫組化染色
    3.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
4 結(jié)果
    4.1 hESCs的多能性鑒定
    4.2 hESCs定向分化為心血管前體細(xì)胞(CVPCs)
    4.3 hESC-CVPCs的免疫源性檢測(cè)
    4.4 多種免疫抑制劑組合MDR能提高移植的hESC-CVPCs細(xì)胞駐留
    4.5 聯(lián)合免疫抑制劑MDR能減少食蟹猴對(duì)hESC-CVPCs免疫排斥
    4.6 多種免疫抑制劑組合MDR能夠顯著增強(qiáng)hESC-CVPCs的抗凋亡作用
    4.7 移植人胚胎干細(xì)胞衍生心血管前體細(xì)胞(hESC-CVPCs)可以顯著改善心梗后非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物心功能
    4.8 免疫抑制劑的肝毒性
5 討論
參考文獻(xiàn)
綜述
    參考文獻(xiàn)
作者簡(jiǎn)介



本文編號(hào)：3796401