目的:美國(guó)40歲以上人群外周動(dòng)脈狹窄的患病率為4.3%(任意一側(cè)下肢踝肱指數(shù)<0.9),70歲以上人群患病率更高達(dá)14.5%。70%的嚴(yán)重下肢缺血患者接受了血管重建治療,其中只有75%的患者下肢功能得到改善。同時(shí),嚴(yán)重下肢缺血的截肢率與死亡率仍分別高達(dá)21.5%和13.5%。在已知的外周動(dòng)脈疾病諸多危險(xiǎn)因素中,吸煙是比高血壓、糖尿病等更為重要的外周動(dòng)脈疾病危險(xiǎn)因素,當(dāng)前吸煙者較不吸煙者外周動(dòng)脈疾病風(fēng)險(xiǎn)高4.46倍。對(duì)于已經(jīng)患病者來(lái)說(shuō)不戒煙則往往會(huì)進(jìn)展為嚴(yán)重的下肢缺血,需要截肢或行血管重建。作為煙草中最廣為人知的有毒成分,尼古丁對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用早有報(bào)道,但其具體分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。細(xì)胞周期異常誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)過(guò)度增殖是導(dǎo)致血管閉塞性疾病發(fā)生及復(fù)發(fā)的關(guān)鍵。同時(shí),越來(lái)越多研究發(fā)現(xiàn)非編碼RNA在血管狹窄過(guò)程中發(fā)揮重要作用,而其如何調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞增殖?其機(jī)制是否與介導(dǎo)細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)?均有待闡明。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期蛋白D(Cyclin D,CCND)與細(xì)胞G1/S期轉(zhuǎn)換有關(guān)并且能夠調(diào)控血管...

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

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摘要
Abstract
英文縮略語(yǔ)
第一部分 尼古丁上調(diào)的linc00665-207通過(guò)促進(jìn)CCND1表達(dá)引起HA-VSMC過(guò)度增殖
    1 前言
    2 材料與方法
        2.1 材料與試劑
            2.1.1 細(xì)胞系
            2.1.2 主要試劑
            2.1.3 主要儀器
        2.2 實(shí)驗(yàn)方法
            2.2.1 酚氯仿法總RNA提取
            2.2.2 離心柱法總RNA提取
            2.2.3 大RNA反轉(zhuǎn)錄
            2.2.4 莖環(huán)法miRNA反轉(zhuǎn)錄
            2.2.5 Real time PCR
            2.2.6 細(xì)胞培養(yǎng)
            2.2.7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染
            2.2.8 細(xì)菌培養(yǎng)
            2.2.9 質(zhì)粒抽提
            2.2.10 CCK-8實(shí)驗(yàn)
            2.2.11 蛋白免疫印跡(Western blot)
            2.2.12 蛋白免疫印跡相關(guān)的液體配置
            2.2.13 劃痕實(shí)驗(yàn)
            2.2.14 細(xì)胞周期檢測(cè)
            2.2.15 凋亡檢測(cè)
            2.2.16 瓊脂糖凝膠電泳
        2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.1 尼古丁促進(jìn)HA-VSMC中CCND1、CCND2的表達(dá)
        3.2 尼古丁促進(jìn)HA-VSMC增殖和遷移、抑制HA-VSMC凋亡
        3.3 Linc00665-207參與尼古丁對(duì)HA-VSMC增殖的影響
            3.3.1 尼古丁處理上調(diào)HA-VSMC中l(wèi)inc00665-207表達(dá)
            3.3.2 過(guò)表達(dá)linc00665-207促進(jìn)HA-VSMC增殖但不影響HA-VSMC遷移和凋亡
            3.3.3 過(guò)表達(dá)linc00665-207促進(jìn)CCND1的表達(dá)但不影響CCND2的表達(dá)
    4 討論
第二部分 尼古丁通過(guò)調(diào)控RelA上調(diào)linc00665-207表達(dá)
    1 前言
    2 材料與方法
        2.1 材料與試劑
            2.1.1 細(xì)胞系
            2.1.2 主要試劑
            2.1.3 主要儀器
        2.2 實(shí)驗(yàn)方法
            2.2.1 酚氯仿法總RNA提取
            2.2.2 離心柱法總RNA提取
            2.2.3 大RNA反轉(zhuǎn)錄
            2.2.5 Real time PCR
            2.2.6 細(xì)胞培養(yǎng)
            2.2.7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染
            2.2.8 細(xì)菌培養(yǎng)
            2.2.9 質(zhì)粒抽提
            2.2.10 CCK-8實(shí)驗(yàn)
            2.2.11 蛋白免疫印跡(Western blot)
            2.2.12 蛋白免疫印跡相關(guān)的液體配置
            2.2.13 染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)
            2.2.14 劃痕實(shí)驗(yàn)
            2.2.15 細(xì)胞周期檢測(cè)
            2.2.16 凋亡檢測(cè)
            2.2.17 瓊脂糖凝膠電泳
            2.2.18 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)
            2.2.19 免疫細(xì)胞化學(xué)
        2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.1 PDGF促進(jìn)HA-VSMC增殖不依賴于RelA激活和linc00665-207表達(dá)的上調(diào)
        3.2 尼古丁能夠上調(diào)并激活RelA
            3.2.1 大劑量尼古丁引起高水平氧化應(yīng)激
            3.2.2 低劑量(10μM)尼古丁即可上調(diào)RelA表達(dá)并促進(jìn)其磷酸化和核轉(zhuǎn)位
        3.3 Linc00665-207參與過(guò)表達(dá)RelA對(duì)HA-VSMC增殖的影響
            3.3.1 過(guò)表達(dá)RelA能進(jìn)一步加劇尼古丁處理的HA-VSMC過(guò)度增殖和遷移能力增強(qiáng)同時(shí)進(jìn)一步降低凋亡水平
            3.3.2 在尼古丁誘導(dǎo)的過(guò)度增殖HA-VSMC中過(guò)表達(dá)RelA能夠進(jìn)一步上調(diào)linc00665-207的表達(dá)
            3.3.3 沉默linc00665-207后能夠減弱過(guò)表達(dá)RelA對(duì)CCND1的上調(diào)并減弱過(guò)表達(dá)RelA對(duì)增殖的促進(jìn)作用
        3.4 尼古丁增強(qiáng)RelA對(duì)linc00665-207的轉(zhuǎn)錄激活
    4 討論
第三部分 linc00665-207通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合hsa-let-7a-5p調(diào)控CCND1的表達(dá)
    1 前言
    2 材料與方法
        2.1 材料與試劑
            2.1.1 細(xì)胞系
            2.1.2 主要試劑
            2.1.3 主要儀器
        2.2 實(shí)驗(yàn)方法
            2.2.1 酚氯仿法總RNA提取
            2.2.2 離心柱法總RNA提取
            2.2.3 大RNA反轉(zhuǎn)錄
            2.2.4 莖環(huán)法miRNA反轉(zhuǎn)錄
            2.2.5 Real time PCR
            2.2.6 細(xì)胞培養(yǎng)
            2.2.7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染
            2.2.8 細(xì)菌培養(yǎng)
            2.2.9 質(zhì)粒抽提
            2.2.10 CCK-8實(shí)驗(yàn)
            2.2.11 蛋白免疫印跡(Western blot)
            2.2.12 蛋白免疫印跡相關(guān)的液體配置
            2.2.13 細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核RNA提取
            2.2.14 RNA結(jié)合蛋白免疫共沉淀
            2.2.15 劃痕實(shí)驗(yàn)
            2.2.16 細(xì)胞周期檢測(cè)
            2.2.17 凋亡檢測(cè)
            2.2.18 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)
            2.2.19 瓊脂糖凝膠電泳
        2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.1 linc00665-207作為CCND1的ceRNA與hsa-let-7a-5p相互作用
            3.1.1 尼古丁對(duì)hsa-let-7a-5p表達(dá)的影響與對(duì)linc00665-207的影響相反
            3.1.2 過(guò)表達(dá)linc00665-207下調(diào)hsa-let-7a-5p表達(dá)
            3.1.3 過(guò)表達(dá)hsa-let-7a-5p能夠恢復(fù)過(guò)表達(dá)linc00665-207引起的CCND1表達(dá)上調(diào)和過(guò)度增殖
        3.2 linc00665-207作為CCND1的ceRNA與hsa-let-7a-5p相互作用
            3.2.1 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和核質(zhì)分離PCR鑒定提示linc00665-207、hsa-let-7a-5p間潛在的ceRNA機(jī)制
            3.2.2 RIP實(shí)驗(yàn)和雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)linc00665-207和hsa-let-7a-5p的分子間直接作用
    4 討論
    5 結(jié)論
本研究創(chuàng)新性的自我評(píng)價(jià)
參考文獻(xiàn)
綜述
    參考文獻(xiàn)
攻讀學(xué)位期間取得的研究成果
致謝
個(gè)人簡(jiǎn)歷



本文編號(hào)：3763005