本文關(guān)鍵詞：NT-proBNP單克隆抗體的研制及ELISA定量檢測(cè)方法的建立，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:心衰是導(dǎo)致多數(shù)心臟病人死亡的最終發(fā)展階段,嚴(yán)重影響了患者的生命健康。因此,如何在心衰發(fā)病的早期及時(shí)診斷、指導(dǎo)臨床醫(yī)生盡早開展抗心衰的治療一直是人們研究的熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn):N端前腦鈉肽(NT-pro BNP)是判定心衰進(jìn)程、發(fā)展的主要標(biāo)志物,其含量變化可敏感及特異地反應(yīng)心室功能的變化和心臟功能的損傷及損傷程度。目前國(guó)內(nèi)關(guān)于NT-pro BNP檢測(cè)產(chǎn)品技術(shù)的研究處于起步階段,所需抗體等主要材料大多依賴進(jìn)口。因此,本研究擬通過(guò)制備抗NT-pro BNP單克隆抗體、并以此為基礎(chǔ)建立一種檢測(cè)人血清中N端前腦鈉肽含量的雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法來(lái)推動(dòng)國(guó)內(nèi)該疾病檢測(cè)方法的進(jìn)步。方法:1.將NT-pro BNP抗原免疫BABL/c小鼠,經(jīng)細(xì)胞融合、陽(yáng)性細(xì)胞株篩選制備NT-pro BNP單克隆抗體。用分別與OVA耦聯(lián)的線性表位片段18~38、35~50、55~72篩選確定所得單抗針對(duì)的線性表位,并通過(guò)間接ELISA特異性分析及亞型分析方法對(duì)所得單抗進(jìn)行特異性及亞型鑒定。2.通過(guò)雙抗體夾心ELISA法對(duì)所得單抗篩選獲取配對(duì)單抗,并以此為基礎(chǔ)通過(guò)包被與封閉條件、包被與酶標(biāo)抗體工作濃度、反應(yīng)模式、室內(nèi)質(zhì)控品及標(biāo)準(zhǔn)品的建立、線性范圍、批內(nèi)、批間精密性、回收率、干擾因素等方面的研究,建立人N端前腦鈉肽ELISA定量檢測(cè)方法。結(jié)果:1.共獲得15株單克隆抗體。單抗亞型及表位鑒定顯示:10株為Ig G1亞型,這10株中有5株針對(duì)18~38線性表位,2株抗體針對(duì)35~50線性表位,3株抗體針對(duì)55~72線性表位,且與心衰相關(guān)標(biāo)志物均無(wú)交叉反應(yīng)。其中,5E10和5G5抗體配對(duì)。另外5株不是針對(duì)特異性表位抗原的單克隆抗體,舍棄。2.本實(shí)驗(yàn)建立的雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法的條件為:包被抗體濃度為4μg/m L,酶標(biāo)稀釋倍數(shù)為1:3 000;反應(yīng)模式為兩步法反應(yīng)模式:37℃樣本孵育30 min,酶標(biāo)孵育30 min,顯色20 min。3.建立的NT-pro BNP檢測(cè)方法:線性范圍為50~500 pg/m L,批內(nèi)及批間精密性分別為2.3%和3.4%。低值、中值及高值的回收率分別為93.7%、97.2%、101.2%。干擾因子脂血、黃疸及低濃度溶血等對(duì)試驗(yàn)結(jié)果無(wú)影響。用200份臨床血清測(cè)試,該試劑臨床總符合率為96.9%,用48份與國(guó)外試劑盒平行測(cè)試,結(jié)果表明兩者具有相關(guān)性,回歸方程:Y=0.8017X+188.3,R2=0.9027。結(jié)論:1.利用單抗制備技術(shù)成功制備出10株NT-pro BNP單抗,并篩選出1對(duì)最優(yōu)的NT-pro BNP檢測(cè)用配對(duì)單抗。2.初步建立了一種用于人血清中N端前腦鈉肽含量檢測(cè)的ELISA方法,該方法具有較高的特異性和精密性�？沙醪綉�(yīng)用于臨床對(duì)NT-pro BNP的檢測(cè),為心衰的早期診斷提供了幫助。
【關(guān)鍵詞】：N 端前腦鈉肽 單克隆抗體 酶聯(lián)免疫反應(yīng)
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R541.6
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 符號(hào)與縮略語(yǔ)11-12
• 常用單位12-13
• 1 引言13-20
• 1.1 項(xiàng)目背景13-14
• 1.2 NT-proBNP的生物學(xué)特征14
• 1.3 NT-proBNP與相關(guān)疾病的關(guān)系14-17
• 1.3.1 NT-proBNP與心衰嚴(yán)重程度14-15
• 1.3.2 NT-proBNP、BNP與高血壓并發(fā)癥15
• 1.3.3 NT-proBNP與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性疾病15-16
• 1.3.4 NT-proBNP與急性冠脈綜合征16
• 1.3.5 NT-proBNP與心房纖顫16
• 1.3.6 NT-proBNP與穩(wěn)定型冠心病16-17
• 1.4 檢測(cè)方法的發(fā)展歷程17-19
• 1.4.1 BNP的放射免疫檢測(cè)技術(shù)17
• 1.4.2 競(jìng)爭(zhēng)性血漿BNP檢測(cè)方法17-18
• 1.4.3 BNP非競(jìng)爭(zhēng)性免疫檢測(cè)技術(shù)18
• 1.4.4 BNP及NT-proBNP的自動(dòng)化及快速檢測(cè)技術(shù)18-19
• 1.5 研究目的和意義19-20
• 2 材料和方法20-43
• 2.1 材料20-28
• 2.1.1 NT-proBNP抗原20
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞株20
• 2.1.3 試劑及材料20-21
• 2.1.4 主要儀器設(shè)備21-22
• 2.1.5 主要溶液的配制22-28
• 2.2 方法28-43
• 2.2.1 NT-proBNP抗原鑒定28-30
• 2.2.2 NT-proBNP單抗的制備30-33
• 2.2.3 NT-proBNP單抗鑒定33-34
• 2.2.4 雙抗體夾心ELISA方法的初步建立34-40
• 2.2.5 線性范圍確定40
• 2.2.6 標(biāo)準(zhǔn)品的制備及保存40-41
• 2.2.7 檢測(cè)體系的工藝研究41-43
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析43-61
• 3.1 NT-proBNP抗原的鑒定43-44
• 3.1.1 抗原濃度的測(cè)定43
• 3.1.2 抗原純度的測(cè)定43
• 3.1.3 抗原生物學(xué)活性鑒定43-44
• 3.2 NT-proBNP單抗的制備44-47
• 3.2.1 間接ELISA檢測(cè)方法的建立44-45
• 3.2.2 免疫效價(jià)檢測(cè)45
• 3.2.3 細(xì)胞融合45
• 3.2.4 細(xì)胞株穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果45-46
• 3.2.5 腹水純化實(shí)驗(yàn)結(jié)果：46-47
• 3.3 單抗的鑒定47-49
• 3.3.1 單抗表位鑒定47
• 3.3.2 單抗亞型鑒定47-48
• 3.3.3 單抗的SDS-PAGE鑒定48-49
• 3.3.4 單抗的特異性鑒定49
• 3.4 雙抗體夾心法的初步建立49-57
• 3.4.1 室內(nèi)質(zhì)控品的建立49-50
• 3.4.2 單克隆抗體的配對(duì)50-51
• 3.4.3 包被條件的確定51-52
• 3.4.4 封閉條件的確定52
• 3.4.5 反應(yīng)體系的確定52-53
• 3.4.6 反應(yīng)模式的研究53
• 3.4.7 線性范圍確定53-54
• 3.4.8 標(biāo)準(zhǔn)品制備及保存54-57
• 3.5 檢測(cè)體系的工藝驗(yàn)證57-61
• 3.5.1 精密性57-58
• 3.5.2 穩(wěn)定性58
• 3.5.3 回收率58-59
• 3.5.4 臨床標(biāo)本檢測(cè)59-60
• 3.5.5 干擾因素檢測(cè)60-61
• 4 討論61-64
• 4.1 陽(yáng)性細(xì)胞株的篩選61
• 4.2 抗體表位篩選61-62
• 4.3 標(biāo)準(zhǔn)品的建立及保存62-63
• 4.4 ELISA檢測(cè)方法63-64
• 5 結(jié)論64-65
• 參考文獻(xiàn)65-71
• 致謝71-73
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷73

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本文編號(hào)：370228