目的探討Toll樣受體4（Toll-like receptor 4,TLR4）/核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear transcription factorκB,NF-κB）信號通路對高磷誘導(dǎo)小鼠血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）成骨樣分化以及血管鈣化過程的影響。方法體外培養(yǎng)小鼠血管平滑肌細(xì)胞系。首先將實(shí)驗(yàn)分為正常對照組和高磷組,觀察高磷對VSMCs的影響;其次分為正常對照組、NF-κB抑制劑吡咯烷二硫代氨基甲酸酯（pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC）組（PDTC組）、高磷組和高磷+PDTC組,觀察PDTC對高磷誘導(dǎo)的VSMCs成骨樣分化及鈣化的抑制作用;最后分為正常對照組、正常對照+control siRNA組、正常對照+TLR4 siRNA組、高磷組、高磷+control siRNA組、高磷+TLR siRNA組,觀察TLR4基因的小分子干擾RNA（siRNA）對高磷誘導(dǎo)的VSMCs成骨樣分化及鈣化的抑制作用。采用茜素紅S染色觀察高磷對細(xì)胞鈣鹽沉積的影響,Western blot檢測TLR4、p-NF-... 

【文章來源】：第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào). 2017,39(08)北大核心CSCD

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【部分圖文】：

茜素紅S染色觀察2組VSMCs鈣鹽沉積情況(×200)

吡鬃?圖1茜素紅S染色觀察2組VSMCs鈣鹽沉積情況(×200)2．2高磷對VSMCs表型蛋白表達(dá)的影響Westernblot檢測結(jié)果顯示，與正常對照組相比，高磷孵育后，高磷組的TLR4、p-NF-κB表達(dá)明顯升高(P＜0.01)，與成骨樣分化及鈣化相關(guān)的BMP2、Runx2蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P＜0.01)，而平滑肌細(xì)胞標(biāo)志物SM22α表達(dá)則明顯減少(P＜0.01，圖2)。表明高磷可誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換，同時(shí)高磷也上調(diào)了TLR4和p-NF-κB蛋白的表達(dá)。1:正常對照組;2高磷組A:Westernblot檢測結(jié)果;B:半定量分析結(jié)果a:P＜0.01，與正常對照組比較圖2Westernblot檢測各組血管平滑肌細(xì)胞蛋白表達(dá)http://aammt．tmmu．edu．cn第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，39(8)733

2．3NF-κB抑制劑PDTC對高磷誘導(dǎo)VSMCs鈣鹽沉積的影響為進(jìn)一步研究NF-κB在高磷誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞鈣化中的作用，使用NF-κB抑制劑PDTC處理血管平滑肌細(xì)胞。VSMCs細(xì)胞爬片的茜素紅S染色結(jié)果顯示，與高磷組相比，經(jīng)過NF-κB抑制劑PDTC預(yù)孵育組的VSMCs鈣鹽沉積明顯減輕(圖3)。半定量檢測結(jié)果顯示，高磷+PDTC組光密度值明顯低于高磷組［(0．121±0．013)vs(0．217±0．031)，P＜0.01］。A:正常對照組;B:PDTC組;C:高磷組;D:高磷+PDTC組圖3茜素紅S染色觀察各組VSMCs鈣鹽沉積情況(×200)2．4NF-κB抑制劑PDTC對高磷誘導(dǎo)的VSMCs表型蛋白表達(dá)的影響Westernblot檢測結(jié)果顯示，與高磷組相比，NF-κB抑制劑PDTC預(yù)孵育后，高磷+PDTC組的p-NF-κB表達(dá)明顯下調(diào)(P＜0.01)。與成骨樣分化及鈣化相關(guān)的BMP2和RUNX2蛋白的表達(dá)也相應(yīng)下降(P＜0.01)，而平滑肌細(xì)胞標(biāo)志物SM22α的表達(dá)則顯著上升(P＜0.01)。提示在使用了NF-κB抑制劑PDTC預(yù)孵育后，p-NF-κB的表達(dá)明顯減少，同時(shí)抑制了高磷誘導(dǎo)VSMCs成骨樣分化和鈣化(圖4)。表明NF-κB參與高磷誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞鈣化。1:正常對照組;2:PDTC組;3:高磷組;4:高磷+PDTC組A:Westernblot檢測結(jié)果;B:半定量分析結(jié)果a:P＜0.001，與高磷組比較圖4Westernblot檢測各組血管平滑肌細(xì)胞蛋白表達(dá)2．5轉(zhuǎn)染TLR4小分子干擾RNA對高磷誘導(dǎo)VSMCs表型蛋白表達(dá)的影響Westernblot檢測結(jié)果顯示，與高磷組相比，轉(zhuǎn)染TLR4小分子干擾RNA后，VSMCs的TLR4［(0．117±0．047)vs(0．377±0．012)，P＜0.01］表達(dá)明顯受到抑制，與此同時(shí)，p-NF-κB［(0．264±0．013)vs(0．601±0．027)，P＜0.01］的表達(dá)也相應(yīng)下降。與成骨樣分化及鈣化相關(guān)的BMP2和RUNX2蛋白的表達(dá)下調(diào)(P＜0.01)，平滑肌細(xì)胞標(biāo)志物SM22α的表達(dá)則顯著上升(P?


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