背景Holt-Oram綜合征,又稱心手綜合征,患者有先天性心臟病伴上肢畸形的臨床表現(xiàn)。該疾病屬于常染色體顯性遺傳病,具有完全外顯性,臨床表現(xiàn)包括先天性房間隔和室間隔缺失、心臟傳導功能障礙、上肢骨骼異常、拇指畸形�；颊叩淖哟杏�50%的可能性發(fā)生新生兒出生缺陷,嚴重者會導致胎兒死亡或夭折,給患者家庭造成極大負擔。研究發(fā)現(xiàn),TBX5基因突變是Holt-Oram綜合征的主要遺傳學因素,約70%的患者存在該基因異常。該基因位于12號染色體,轉(zhuǎn)錄后形成的TBX5蛋白是胚胎發(fā)育過程中調(diào)控心臟和上肢發(fā)育的重要轉(zhuǎn)錄因子。目前在TBX5基因編碼區(qū)、剪接區(qū)和調(diào)控區(qū)均發(fā)現(xiàn)了導致Holt-Oram綜合征的基因突變。另外,約30%該疾病患者病因尚不明確,可能存在其他影響心臟和上肢胚胎發(fā)育的調(diào)控元件。TBX5基因突變的異質(zhì)性和其與Holt-Oram綜合征的相關(guān)性提示,該基因在胚胎發(fā)育中具有重要調(diào)控作用和研究價值。目的鑒定Holt-Oram綜合征家系的致病基因和遺傳方式,為患者提供遺傳咨詢;鑒定TBX5基因新突變,豐富Holt-Oram綜合征基因突變異質(zhì)性研究,拓寬基因突變譜;針對TBX5基因新突變的功能研究,揭示... 

【文章來源】：鄭州大學河南省 211工程院校

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【學位級別】：碩士

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圖２．１?Ｔ５Ｘ５?ｃＤＮＡ原質(zhì)粒圖譜及ＰＣＲ引物結(jié)合區(qū)域??（Ａ：?：Ｔ５Ｚ５ｃＤＮＡ原質(zhì)粒圖譜；Ｂ和Ｃ：質(zhì)粒Ｎ端和Ｃ端ＰＣＲ引物結(jié)合區(qū)域）??

?材料與方法???藍指示位置超過凝膠１／２時可結(jié)束電泳。??顯影：使用ＣｈｅｍｉＤｏｃ?ＭＰ成像儀顯影，選擇Ｉｍａｇｅ?Ｌａｂ程序并預熱，將加??樣孔朝上置于成像板內(nèi)并驅(qū)除接觸面的氣泡。顯影后根據(jù)Ｍａｒｋｅｒ指示確定目標??條帶位置（約１．６?ｋｂ）并保存圖片，條帶位置見圖２．２。??Ｍａｒｋｅｒ?ｗｔ?ｆｌａｇ－ＴＢＸ５??圖２．２?７５Ｘ５基因擴增后的瓊脂糖凝膠電泳圖??ｅ）膠回收得到純化的目的基因片段：??佩戴紫外線防護眼鏡，使用Ｅ－Ｇｅｌ?Ｓａｆｅ?Ｉｍａｇｅｒ透射儀直視下切割目的片段，??盡量靠近目的區(qū)域以減小切割體積，將切下的凝膠塊裝入１．５?ｍｌ離心管內(nèi)并稱??重。膠回收的純化過程均在室溫下進行，離心轉(zhuǎn)速＞１２０００?ｇ。??按照１：１的比例向凝膠內(nèi)加入Ｂｉｎｄｉｎｇ?Ｂｕｆｆｅｒ，置于５５°Ｃ金屬浴中孵育１０??ｍｉｎ使凝膠完全溶解；將溶解后的凝膠轉(zhuǎn)移至ＧｅｎｅＪＥＴ純化柱內(nèi)，離心１?ｍｉｎ，??倒掉收集管內(nèi)的液體；向純化柱內(nèi)加入７００ｕｌＷａｓｈＢｕｆｆｅｒ?（已加入需要量的無水??乙醇），離心ｌｍｉｎ，倒掉收集管內(nèi)的液體，再離心１ｍｍ以去除殘留的乙醇成分；??將純化柱轉(zhuǎn)移至干凈的１．５ｍｌ離心管內(nèi)，向純化柱膜中央滴加２０ｕｌ洗脫液，離??心ｌｍｍ，離心管內(nèi)即得到純化的目的片段。測量濃度，并記錄。??③酶切目的基因和質(zhì)粒載體并純化回收：??連有Ｈａｇ標簽的目的基因ＴＡＹ５兩側(cè)有限制性核酸內(nèi)切酶ＢａｍＨＩ和Ｐｍｅｌ??序列，質(zhì)粒載體ｐＣＭＶ６的開放閱讀框兩側(cè)也含有ＢａｍＨＩ和Ｐｍｅｌ序列，雙酶切??可獲得ＢａｍＨＩ酶切后的黏末端和Ｐｍｅｌ酶切后的平末端。通過瓊脂糖凝膠電泳，??根據(jù)片段長度對

?材料與方法???ａ）目的基因和質(zhì)粒載體的酶切???試劑名稱????ＢａｍＨＩ?酶?１?ｕｌ??Ｐｍｅｌ?酶?１?ｕｌ??ｌＯｘＮＥＢｕｆｆｅｒ?５?ｕｌ??目的基因／質(zhì)粒載體ＤＮＡ?１?ｕｇ??去離子水?Ｓ?５０?ｕｌ???按照上表配制５０ｕｌ的酶切體系，注意酶最后加入并吹打混勻。置于３７°Ｃ孵??育１?ｈ，使酶充分發(fā)揮作用。??ｂ）純化回收目的片段??將酶切后的反應體系進行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖２．３：連有Ｆｌａｇ標簽的??目的基因片段大小約１．６?ｋｂ，質(zhì)粒載體酶切后獲得約４．８?ｋｂ大小的ｐＣＭＶ６??骨架和約１．６?ｋｂ大小的開放閱讀框區(qū)域。切膠回收目的基因的１．６?ｋｂ區(qū)域和質(zhì)??粒載體的４．８?ｋｂ區(qū)域。具體步驟同２．２．４－（１）－②－ｃ）．ｄ）．ｅ）所述。??圓??圖２．３目的基因和質(zhì)粒載體ｐＣＭＶ６酶切后的瓊脂糖凝膠電泳圖??④連接目的基因和質(zhì)粒載體：??使用Ｔ４?ＤＮＡ連接酶使質(zhì)粒載體和目的基因上經(jīng)過ＢａｍＨＩ酶切形成的黏末??端互補配對結(jié)合并連接，同時Ｐｍｅｌ酶切形成的平末端相連，形成閉合完整的環(huán)??狀質(zhì)粒結(jié)構(gòu)。???試劑名稱????Ｔ４?ＤＮＡ?Ｌｉｇａｓｅ?１?ｕｌ??ｌ〇ｘＴ４?ＤＮＡ?Ｌｉｇａｓｅ?Ｂｕｆｆｅｒ?２?ｕｌ??質(zhì)粒載體?ＤＮＡ（４．８?ｋｂ）?６０?ｎｇ?（０．０３２?ｐｍｏｌ）??目的基因?ＤＮＡ（１．６?ｋｂ）?６０?ｎｇ?（０．０９６?ｐｍｏｌ）??去離子水?至２０ｕｌ???１５??

【參考文獻】：
期刊論文
[1]遺傳變異分類標準與指南[J]. 王秋菊,沈亦平,鄔玲仟,陳少科,陳子江,方向東,傅松濱,龔瑤琴,黃國英,黃國寧,黃荷鳳,黃山,郝曉柯,冀小平,李紅,梁波,廖燦,喬杰,蘇海翔,魏軍,王磊,王樹玉,王曉紅,邢清和,徐湘民,袁慧軍,楊正林,周從容,周文浩,曾勇,張學軍,黃濤生,鄭茜,秦勝營,于世輝,關(guān)靜,王洪陽,王大勇,趙立東,王慧君,孔令印,宣黎明,冒燕,祝軼君,徐君玲,王劍青,王莉,趙婷,秦一丁,夏瀅穎,樊麗霞,趙丁丁,邱浩,賀林.  中國科學:生命科學. 2017(06)



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