本文的主要目的是探究過表達(dá)自噬相關(guān)蛋白Atg5對(duì)主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞自噬水平以及成骨樣分化能力的影響,為鈣化性主動(dòng)脈瓣膜疾病的研究提供新方法和新思路。從豬主動(dòng)脈瓣上分離原代瓣膜間質(zhì)細(xì)胞,細(xì)胞免疫熒光進(jìn)行表型鑒定后,采用成骨培養(yǎng)基誘導(dǎo)瓣膜間質(zhì)細(xì)胞成骨分化,并用Western blot檢測(cè)細(xì)胞Runx2、OPN表達(dá)分析細(xì)胞成骨分化能力,WB檢測(cè)p62和LC3B-Ⅰ/Ⅱ的表達(dá)分析胞內(nèi)自噬水平;構(gòu)建過表達(dá)ATG5的重組質(zhì)粒pAdTrack-ATG5并通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染瓣膜間質(zhì)細(xì)胞,采用Q-PCR、Western blot以及免疫熒光染色檢測(cè)轉(zhuǎn)染pAdTrack-ATG5后細(xì)胞Atg5的表達(dá)水平和細(xì)胞自噬水平的變化情況;對(duì)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)的主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒和過表達(dá)Atg5質(zhì)粒,利用Western blot檢測(cè)72 h后瓣膜間質(zhì)細(xì)胞早期成骨指標(biāo)Runx2、OPN的表達(dá),并利用堿性磷酸酶染色和茜素紅S染色方法檢測(cè)Atg5對(duì)瓣膜間質(zhì)細(xì)胞在誘導(dǎo)環(huán)境下的早晚期成骨樣分化能力。結(jié)果顯示,原代分離培養(yǎng)的瓣膜間質(zhì)細(xì)胞的間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA和Vimentin的染色結(jié)果呈陽性,內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物vWF的染色... 

【文章來源】：重慶醫(yī)科大學(xué)重慶市

【文章頁數(shù)】：38 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

豬主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞的表型鑒定Fig.1Phenotypicidentificationofporcineaorticvalveinterstitialcells

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文12水平在第1天高于正常培養(yǎng)基培養(yǎng)的VICs(CM組)(P<0.01，OPN和p62的蛋白表達(dá)水平在第3天高于CM組(P<0.05)，Ⅱ型LC3B與I型LC3B的比值在第1天和第3天均低于CM組(P<0.001)(圖2A和圖2B)。同時(shí)，通過向pVICs轉(zhuǎn)導(dǎo)表達(dá)LC3B-GFP融合蛋白的腺病毒后，在激光共聚焦顯微鏡可見，成骨培養(yǎng)基培養(yǎng)的pVICs自噬小體數(shù)量相較于對(duì)照組明顯減少（圖2C）。以上結(jié)果提示成骨分化的瓣膜間質(zhì)細(xì)胞自噬水平呈下降趨勢(shì)。圖2自噬水平在瓣膜鈣化模型中的檢測(cè)Fig.2Detectionofautophagiclevelinvalveinterstitialcells

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文17圖3質(zhì)粒pAdTrack-ATG5的構(gòu)建及鑒定Fig.3ConstructionandidentificationoftheplasmidpAdTrack-ATG52.2過表達(dá)ATG5上調(diào)VICs自噬水平Q-PCR結(jié)果(圖4A)顯示,轉(zhuǎn)染4μg和8μg重組質(zhì)粒pAdTrack-ATG524h后，瓣膜間質(zhì)細(xì)胞ATG5的mRNA表達(dá)水平顯著高于NC組(P<0.001,P<0.001)，轉(zhuǎn)染4μg重組質(zhì)粒后VICs的mRNA水平高于8μg組(P<0.001)。Westernblot結(jié)果(圖4B和圖4C)顯示，在轉(zhuǎn)染48h后，過表達(dá)Atg5組中Atg5的蛋白表達(dá)水平顯著高于NC組(P<0.001)，Ⅱ型LC3B與Ⅰ型LC3B的比值與NC組相比顯著增加(P<0.05)，p62的蛋白表達(dá)則顯著低于NC組(P<0.05)。免疫熒光結(jié)果(圖4D)也表明，過表

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號(hào)：3513846