發(fā)布時(shí)間：2021-10-30 07:14

　　目的:篩選并鑒定出可能會(huì)作為免疫相關(guān)性全血細(xì)胞減少（immuno-related pancytopenia,IRP）患者骨髓造血細(xì)胞上的自身抗原。背景:IRP是一種免疫介導(dǎo)的血細(xì)胞減少癥。前期研究發(fā)現(xiàn)IRP發(fā)病機(jī)制首先是某種原因引起T淋巴細(xì)胞調(diào)控失衡,Th2細(xì)胞比例增多導(dǎo)致B淋巴細(xì)胞數(shù)量/亞群/功能異常,進(jìn)而產(chǎn)生抗骨髓未成熟造血細(xì)胞自身抗體并破壞或抑制骨髓造血,最后引起的血細(xì)胞減少癥候群。但是IRP自身抗體所攻擊的造血細(xì)胞上的靶抗原目前尚不明確,之前本中心利用SDS-PAGE聯(lián)合免疫印跡法發(fā)現(xiàn)了幾種靶抗原,包括G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）156變異體,P鏈人紅細(xì)胞帶3蛋白,乳鐵蛋白及WD重復(fù)序列蛋白。自身免疫性疾病的靶抗原往往數(shù)個(gè)甚至數(shù)十個(gè),所以以上方法所驗(yàn)證的抗原僅為極少數(shù),因此本實(shí)驗(yàn)采用重組cDNA表達(dá)文庫的血清學(xué)分析法（SEREX）繼續(xù)尋找IRP自身抗體的靶抗原,并且進(jìn)一步驗(yàn)證其抗原性。材料與方法:我們構(gòu)建了K562細(xì)胞的噬菌體展示文庫,用它替代人骨髓CD34+細(xì)胞的蛋白文庫。然后用IRP患者和正常健康對照血清對這個(gè)文庫進(jìn)行血清免疫學(xué)分析。噬菌體表達(dá)蛋白的初步挑選是建立在患者與正常... 

【文章來源】：天津醫(yī)科大學(xué)天津市 211工程院校

【文章頁數(shù)】：116 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA質(zhì)量

圖 1 瓊脂糖凝膠電泳檢測總 RNA 質(zhì)量1.2.2 LD-PCR 瓊脂糖凝膠電泳圖2的Lane1,3,5,7,9,11分別為K562細(xì)胞一鏈cDNA經(jīng)過LD-PCR18,20,22,24,26,28個(gè)循環(huán)后后合成二鏈的電泳結(jié)果。Lane2,4,6,8,10,12為試劑盒自帶的陽性對照標(biāo)本的結(jié)果。最佳的電泳結(jié)果應(yīng)為smear狀，并且里邊沒有明顯的條帶，根據(jù)電泳結(jié)果選擇了22個(gè)循環(huán)條件作為最佳的條件。圖3顯示該條件下對應(yīng)的結(jié)果Lane5的smear分布為4000bp以內(nèi)，符合人類mRNA大小的分布范圍。

圖 3 .LD-PCR22 個(gè)循環(huán)電泳結(jié)果。Lane1 為 K562，Lane2 為陽性對照，圖 4 .藍(lán)白斑檢測測定文庫的重組率1.2.3 過柱后 cDNA 凝膠電泳cDNA構(gòu)建cDNA文庫是最佳選擇，小于500bp的DNA片量，提高文庫滴度，但這將極大地增加下一步篩選的工作量文庫應(yīng)選擇適當(dāng)大小的cDNA。本實(shí)驗(yàn)采用Chrome Spin-400cDNA，取500bp以上cDNA回收去除了小片斷DNA，提高了5的Lane1-17分別為過柱后收集的1-17滴液體，并且第8，9，而且小片段(<100bp)比較少，因此取這3管液體混合。圖 5.過柱后 cDNA 凝膠電泳圖

【參考文獻(xiàn)】：
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本文編號：3466305