冠心病新危險(xiǎn)標(biāo)志物ADMA與促炎因子MIF和AGEs的相關(guān)性研究
本文關(guān)鍵詞:冠心病新危險(xiǎn)標(biāo)志物ADMA與促炎因子MIF和AGEs的相關(guān)性研究,由筆耕文化傳播整理發(fā)布。
【摘要】:研究背景 心血管疾病在發(fā)達(dá)國家已成為致死率最高的疾病,在發(fā)展中國家也日趨嚴(yán)重,每年導(dǎo)致約1670萬人死亡。這其中,尤其是冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(又稱冠心病,coronary heart disease, CHD)嚴(yán)重威脅現(xiàn)代人類生命健康。CHD根本的病理學(xué)特征就是冠狀動脈粥樣硬化(AS)。近年來隨著對疾病的研究深入,證明炎癥反應(yīng)在AS的發(fā)生與發(fā)展過程中起著重要作用。 目前臨床實(shí)踐中,血清C反應(yīng)蛋白(CRP)的檢測可作為反映機(jī)體動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過程的一項(xiàng)最敏感的炎性指標(biāo)。但研究發(fā)現(xiàn),CRP在所有的炎性癥狀下都會升高,因而對于CHD的診斷缺乏特異性。流行病學(xué)研究證明高血脂、高血壓、糖尿病以及吸煙等危險(xiǎn)因素與冠心病的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系。但是大約50%的心血管疾病患者并不能用傳統(tǒng)意義上的危險(xiǎn)因素來解釋。提前診斷對于心血管疾病這類慢性、長期而嚴(yán)重的疾病來說是重要的,因此迫切需要更好的生物標(biāo)志物來預(yù)測未來發(fā)生冠心病的風(fēng)險(xiǎn),這樣將在疾病早期就可以進(jìn)行干預(yù),改善甚至逆轉(zhuǎn)疾病進(jìn)程。 非對稱性二甲基精氨酸(asymmetric dimethylarginine, ADMA)是蛋白質(zhì)上的精氨酸殘基在蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(protein arginine methyltransferase,PRMT-1)的催化作用下產(chǎn)生;大部分ADMA由二甲基精氨酸-二甲胺水解酶(Dimethyl arginine dimethylaminohydrolase-2, DDAH-2)水解代謝。ADMA的升高與PRMT-1與DDAH-2這兩個酶的活性或含量改變有關(guān)。ADMA能與L-精氨酸競爭,是一種內(nèi)源性的一氧化氮合酶(NOS)競爭性抑制劑,能使具血管保護(hù)作用性物質(zhì)一氧化氮(NO)的生成減少,而導(dǎo)致內(nèi)皮功能的紊亂。研究表明,高ADMA血癥與心腦血管疾病密切相關(guān),ADMA可能是動脈粥樣硬化一個新的危險(xiǎn)因素。 巨噬細(xì)胞移動抑制因子(macrophage migration inhibitory factor, MIF)是在結(jié)構(gòu)上高度保守的、獨(dú)特的免疫調(diào)節(jié)因子;也是一種強(qiáng)有力的炎癥前細(xì)胞因子,主要來源于T細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞。近十年來我們課題組對其做了大量研究,MIF與心血管疾病相關(guān)如動脈硬化、心衰等疾病呈正相關(guān)性。 晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycated end-products, AGEs)是蛋白被糖化修飾后的產(chǎn)物,在正常老化過程中,AGEs逐步形成和積累,但在高血糖或氧化應(yīng)激條件下AGEs則會加速積累。臨床研究證明,AGEs能促進(jìn)動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展。 為探尋冠心病新的生物標(biāo)志物,本課題將圍繞ADMA與促炎因子MIF、AGEs的關(guān)系展開研究。 第一章冠心病患者外周血漿中ADMA、MIF的含量測定 1.1研究目的 檢測冠心病患者血漿中ADMA、MIF的含量,并與健康人比較,分析ADMA、MIF與疾病的關(guān)系,并進(jìn)一步分析ADMA與MIF的關(guān)系。探討ADMA是否可作為冠心病潛在的預(yù)測、預(yù)后指標(biāo)乃至潛在的治療耙點(diǎn)。 1.2研究方法 1.2.1標(biāo)本的采集與處理 1.于2011年7月至2011年12在廣東省人民醫(yī)院心血管病研究所收集經(jīng)冠狀動脈造影確診為冠心病患者肘靜脈血2ml于EDTA抗凝管中(早晨,在患者空腹時(shí)),(4℃,1500rpm/min)離心20分鐘,收集上層血漿于無菌1.5ml EP管中,-70℃保存,待用;在體檢中心收集健康對照人群樣本,血液處理方法同上。 2.查詢所患者病歷,排除標(biāo)準(zhǔn)為長期服用免疫抑制劑史;再發(fā)性心肌梗死;惡性腫瘤;腎功能不全;近半年內(nèi)接受過重大手術(shù);有急性或慢性感染性疾;嚴(yán)重電解質(zhì)紊亂的患者。 3.病例組根據(jù)有沒有接受PCI以及PCI術(shù)后的時(shí)間長短分為三個亞組:分別指確診為冠心病但沒有接受PCI的病例、剛接受PCI術(shù)的病例(七天內(nèi))、及人大于6個月的病例。1.2.2人血漿中MIF及ADMA含量的檢測 (1) Elisa檢測人血漿中MIF的含量 MIF的測定采用定量的酶聯(lián)免疫測定法(ELISA法)。 (2) Elisa檢測人血漿中ADMA的含量 ADMA的測定采用定量的酶聯(lián)免疫測定法(ELISA法)。1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測MIF、CD74mRNA表達(dá)水平 提取全血中白細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后,分別使用MIF、CD74的特異引物,內(nèi)參為β-actin,從基因水平檢測mRNA的相對表達(dá)。 1.2.4ADMA與MIF的相關(guān)性研究 采用Pearson相關(guān)分析,分析ADMA與MIF的相關(guān)性。 1.3研究結(jié)果 1.3.1人血漿中ADMA、MIF及含量的檢測 (1)對照組與冠心病組外周血漿中MIF的含量分別為:1103±508.0pg/ml(對照組,n=62);1422±697.2pg/ml(冠心病組,n=173)(p0.01),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。接受PCI術(shù)后的時(shí)間長短與MIF含量無顯著關(guān)系(p0.05),但可以看到在接受PCI后,隨著時(shí)間的延長其MIF的含量有降低趨勢。 (2)檢測ADMA結(jié)果為:對照組,170.7±19.93ng/ml,n=24;冠心病組,253.8±12.88ng/ml,n=80p0.01),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 1.3.2MIF mRNA與CD74mRNA相對表達(dá)水平 冠心病人群中MIF與CD74mRNA的相對表達(dá)水平與健康組相比有上升的趨勢,但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(見圖1-4C)。 1.3.3ADMA與MIF的相關(guān)性研究Pearson分析結(jié)果為,r=0.238,p=0.035,ADMA與MIF顯示出相關(guān)性。 1.4結(jié)論 本研究結(jié)果顯示,冠心病患者血漿ADMA與對照組相比明顯增高,并伴隨著促炎因子MIF的增高,ADMA與MIF顯示出相關(guān)性。提示ADMA可能參與了慢性炎癥過程,并可作為判斷冠心病病情活動的有效指標(biāo)。 第二章ADMA與MIF相互作用的研究 2.1研究目的 以人內(nèi)皮細(xì)胞為研究對象,通過探討ADMA與MIF相互作用,研究ADMA是否參與了炎癥所致的內(nèi)皮損傷過程及其在動脈粥樣硬化中的可能病理生理機(jī)制。 2.2實(shí)驗(yàn)方法 2.2.1Eahy926細(xì)胞的培養(yǎng) 于6孔板中培養(yǎng),使用DMEM F12培養(yǎng)基,10%FBS,當(dāng)細(xì)胞融合70%時(shí),先用PBS洗兩遍,然后加入含1%FBS的培養(yǎng)基過夜后,加入含不同濃度MIF(0,2,5,20ng/ml),共培養(yǎng)24小時(shí)。 2.2.2細(xì)胞總RNA的提取 按2.2.1方法處理細(xì)胞結(jié)束后,采用Trizol法提取細(xì)胞中的RNA。 2.2.3RT-qPCR檢測細(xì)胞總RNA中相關(guān)蛋白mRNA相對表達(dá)水平 首先逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,然后Q-RCR檢測測組織因子(TF)、基質(zhì)蛋白酶(MMP-1)、內(nèi)皮素(ET-1)、PRMT-1、DDAH-2、內(nèi)皮型一氧化氮合成酶(eNOS) mRNA相對表達(dá)水平。 2.2.4硝酸根亞硝酸酶法檢測細(xì)胞上清中NO水平按2.2.1方法細(xì)胞處理結(jié)束后,收集細(xì)胞培養(yǎng)基上清液測NO。 2.2.5熒光顯微鏡檢測Eahy926中ROS水平 按2.2.1方法處理細(xì)胞結(jié)束后,加入適量DCFH-DA溶液,使培養(yǎng)液中DCFH-DA終濃度為10μM,將培養(yǎng)板放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱孵育15min。15min后按比例(1:1000)再加入Hoechst33342,37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育15min。去除細(xì)胞上清,用PBS輕輕洗2-3次后,每孔加入1mL培養(yǎng)基,熒光顯微鏡觀察各組細(xì)胞熒光信號的變化并拍攝熒光照片。 2.2.6ADMA處理內(nèi)皮細(xì)胞后檢測MIF的表達(dá) 按2.2.1方法處理細(xì)胞,采用ADMA處理,分別為0、5、20、ADMA分別采用免疫熒光與Western blot檢測MIF的表達(dá)水平。 2.3結(jié)果 2.3.1細(xì)胞總RNA中相關(guān)蛋白mRNA相對表達(dá)情況 在使用20ng/ml MIF刺激時(shí),ET-1、TF及MMP-1的mRNA的相對表達(dá)水平都明顯升高(p0.05);與此同時(shí),與NO生成相關(guān)的eNOS、DDAH-2mRNA水平則降低(p0.05),RPMT-1的變化不顯著(詳細(xì)結(jié)果見圖2-1)。 2.3.2細(xì)胞上清中NO水平 加入20ng/ml組NO均值為14.4μM,Control組均值為27.5μMp0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,其他組變化不顯著。 2.3.3內(nèi)皮細(xì)胞中ROS水平 熒光顯微鏡下,20ng/ml MIF組中,代表ROS水平的綠色熒光比Control增加明顯,其他濃度組則增多不明顯(詳細(xì)結(jié)果見圖2-2)。 2.3.4ADMA處理內(nèi)皮細(xì)胞檢測MIF的表達(dá)情況 在20、50μMADMA組,MIF的表達(dá)明顯增多(詳細(xì)結(jié)果見圖2-3與2-4)。 2.4結(jié)論 MIF能通過影響炎性因子的表達(dá)以及ROS的生成,從而影響ADMA相關(guān)代謝酶的變化。同時(shí),ADMA亦能上調(diào)MIF在內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá),驗(yàn)證了ADMA的促炎作用。 第三章ADMA與AGEs相互作用的研究 3.1研究目的 探討AGEs是否影響PRMT-1/ADMA/DDAH-2通路而影響NO的生成,而導(dǎo)致內(nèi)皮功能紊亂,促進(jìn)動脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展,從而進(jìn)一步驗(yàn)證ADMA的促炎作用。 3.2研究方法 3.2.1AGEs對ADMA相關(guān)代謝酶PRMT-1與DDAH-2的基因表達(dá)水平的影響 使用不同濃度的AGEs(0,20,50,100μg/ml)處理Eahy926細(xì)胞,并加入沒有糖基化的球蛋白做陰性對照,共培養(yǎng)24、48小時(shí)。細(xì)胞處理結(jié)束后,采用Trizol法提取總RNA,實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測PRMT-1與DDAH-2mRNA的相對表達(dá)水平。 3.2.2AGEs對ADMA相關(guān)代謝酶PRMT-1與DDAH-2的蛋白表達(dá)水平的影響 按3.2.1方法細(xì)胞處理結(jié)束后,提取總蛋白,采用western blot檢測PRMT-1與DDAH-2的蛋白表達(dá)水平。 3.2.3熒光顯微鏡檢測AGEs處理內(nèi)皮細(xì)胞后ROS的變化 按3.2.1方法細(xì)胞處理結(jié)束后,按2.2.5法檢測ROS。 3.3結(jié)果 1. AGEs對ADMA相關(guān)代謝酶PRMT-1與DDAH-2的基因表達(dá)水平的影響 50μg/ml和100μg/mlAGEs組中,PRMT-1mRNA相對表達(dá)水平(folds)與Control組和陰性對照組相比上升明顯;而DDAH-2mRNA (folds)與Control組和陰性對照組相比顯著下降(p0.01),同時(shí)Control組和陰性對照組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而25μg/ml組(folds)則與對照組和陰性對照組相比差異不明顯。(詳細(xì)結(jié)果見圖3-1) 2. AGEs對ADMA相關(guān)代謝酶PRMT-1、DDAH-2表達(dá)水平的影響 當(dāng)使用20μg/ml、50μg/ml、100μg/mlAGEs刺激24h時(shí),與Control組相比,PRMT-1蛋白表達(dá)上升明顯;DDAH-2則在50μg/ml、100μg/mlAGEs刺激24h時(shí)下降;同時(shí)在培養(yǎng)48小時(shí)時(shí),看到了相同的趨勢。(詳細(xì)結(jié)果見圖3-2與3-3) 3.熒光顯微鏡檢測AGEs處理內(nèi)皮細(xì)胞后ROS的變化 熒光顯微鏡下觀察,與對照組和陰性對照組相比,加入20gg/ml、50μg/ml、100μg/mlAGEs各組中,代表ROS綠色熒光相對生成較多,其中100μg/mlAGEs組ROS含量最多。(詳細(xì)結(jié)果見圖3-4) 3.4結(jié)論 AGEs可以通過誘導(dǎo)ROS的生成,影響PRMT-1/ADMA/DDAH-2通路。 全文小結(jié): 1.本研究結(jié)果顯示,冠心病患者血漿ADMA與對照組相比明顯增高,并伴隨促炎因子MIF的增高,ADMA與MIF顯示出相關(guān)性。揭示了炎性反應(yīng)、內(nèi)皮功能與心血管疾病之間的關(guān)系,提示ADMA可能參與了慢性炎癥過程,并可作為判斷冠心病病情活動的有效指標(biāo)。 2.發(fā)現(xiàn)了MIF能夠影響ADMA-NO通路,而ADMA也能增加MIF的表達(dá),驗(yàn)證了ADMA的促炎作用。 3. AGEs通過誘導(dǎo)ROS生成,影響PRMT-1/ADMA/DDAH-2通路。
【關(guān)鍵詞】:非對稱性二甲基精氨酸 巨噬細(xì)胞動抑制因子 晚期糖基化終末產(chǎn)物 冠心病
【學(xué)位授予單位】:南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】:碩士
【學(xué)位授予年份】:2013
【分類號】:R541.4;R96
【目錄】:
- 摘要3-11
- ABSTRACT11-22
- 第一章 冠心病患者外周血漿中MIF、ADMA的含量測定22-44
- 前言22-28
- 1.1 主要試劑與儀器28-29
- 1.2 主要試劑配置29-30
- 1.3 實(shí)驗(yàn)方法30-36
- 1.4 統(tǒng)計(jì)方法36
- 1.5 結(jié)果36-40
- 1.6 討論40-44
- 第二章 ADMA與MIF相互作用的研究44-61
- 前言44
- 2.1 主要試劑和儀器44-46
- 2.2 主要配置的試劑46-47
- 2.3 方法47-53
- 2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法53-54
- 2.5 結(jié)果54-58
- 2.6 討論58-61
- 第三章 ADMA與AGEs相互關(guān)系的研究61-71
- 前言61-62
- 3.1 主要試劑與儀器62
- 3.2 主要試劑與配置62-63
- 3.3 實(shí)驗(yàn)方法63-65
- 3.4 結(jié)果65-69
- 3.5 討論69-71
- 展望71-72
- 全文總結(jié)72-73
- 參考文獻(xiàn)73-80
- 縮寫詞簡表80-82
- 碩士研究生期間發(fā)表論文情況82-83
- 參加國內(nèi)國際會議83-84
- 致謝84-86
- 統(tǒng)計(jì)學(xué)審稿證明86
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8 王鈺;體外心臟震波(CSWT)治療冠心病的療效、安全性和方法學(xué)研究[D];昆明醫(yī)學(xué)院;2010年
9 方葉青;冠心病患者EPC的變化及LPS和羅格列酮干預(yù)EPC后纖溶和炎癥因子變化的研究[D];中南大學(xué);2008年
10 李耀輝;從氣血相關(guān)和“通則不病”探討冠心病微血管新生機(jī)理的實(shí)驗(yàn)研究[D];北京中醫(yī)藥大學(xué);2010年
中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條
1 駱驊;冠心病新危險(xiǎn)標(biāo)志物ADMA與促炎因子MIF和AGEs的相關(guān)性研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2013年
2 徐建;血漿內(nèi)皮脂酶水平與冠心病的發(fā)病關(guān)系的研究[D];浙江大學(xué);2010年
3 嚴(yán)建軍;Visfatin啟動子區(qū)基因多態(tài)性與冠心病相關(guān)性研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2010年
4 邢燕;老年、青年冠心病患者危險(xiǎn)因素及冠脈造影結(jié)果分析[D];遼寧中醫(yī)藥大學(xué);2010年
5 吳志勤;血清脂蛋白a與冠心病的相關(guān)性研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2011年
6 張濤;冠心病患者調(diào)脂治療中膽固醇代謝標(biāo)志物動態(tài)變化的研究[D];南華大學(xué);2010年
7 張偉偉;冠心病患者血漿PZ水平的檢測及臨床意義[D];中南大學(xué);2010年
8 嚴(yán)鴻雁;282例冠脈造影患者血尿酸水平與冠心病的相關(guān)性研究[D];新疆醫(yī)科大學(xué);2010年
9 曹蕊;冠心病患者中醫(yī)舌象與冠脈病變程度及生化指標(biāo)的相關(guān)性研究[D];黑龍江中醫(yī)藥大學(xué);2010年
10 龔厚文;冠心病患者局部左心功能與B型利鈉肽變化的相關(guān)性研究[D];瀘州醫(yī)學(xué)院;2010年
本文關(guān)鍵詞:冠心病新危險(xiǎn)標(biāo)志物ADMA與促炎因子MIF和AGEs的相關(guān)性研究,由筆耕文化傳播整理發(fā)布。
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