研究目的短QT綜合征（Short QT syndrome,SQTs）是一種極其罕見,異源基因遺傳的心臟離子通道病,該病以心電圖上QT間期、心室及心房不應(yīng)期的明顯縮短為主要臨床特征,同時可以引起惡性心律失常而導(dǎo)致心源性猝死的發(fā)生。SQTs具有家族遺傳性,其發(fā)病機制尚不明確,在臨床上缺少特效藥物,嚴(yán)重危害患者健康�，F(xiàn)已有6種SQTs亞型被發(fā)現(xiàn),其中1型、2型及3型均與鉀離子通道的功能性改變有關(guān)。KCNH2（Potassium voltage-gated channel subfamily H member 2）基因是最早被確認(rèn)的致病基因的突變位點,但還沒有較為完整的研究去闡述為何KCNH2突變會引發(fā)SQTs,目前仍未發(fā)現(xiàn)針對此種位點突變的有效治療藥物。因此,基于之前的研究及文獻報道,本課題的研究目的是建立SQTs病人特異性的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells,i PSCs）模型研究疾病的發(fā)病機制,并通過i PSCs衍生的心肌細(xì)胞進行靶向藥物的篩選。研究方法本課題成功入組了1例攜帶KCNH2 T618I位點突變的SQTs患者以及2例健康受試者,并建立... 

【文章來源】：浙江大學(xué)浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：111 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

SQTs病人臨床資料。

本課題分別取得了3位受試者的皮膚活檢樣本,并在取得樣本組織后進行了皮膚成纖維細(xì)胞的體外培養(yǎng)實驗,圖2A是由樣本培養(yǎng)產(chǎn)生的成纖維細(xì)胞。應(yīng)用非整合仙臺病毒介導(dǎo)的方法對皮膚成纖維細(xì)胞進行重編程,獲得了對照組和病人組的iPSCs,圖2B所示是單克隆狀態(tài)下生長的iPSCs。為了確定所得細(xì)胞株是否具有堿性磷酸酶的活性,依次對三組細(xì)胞株進行了AP染色,代表結(jié)果如圖2C所示。最后,使用OCT4、SOX2、NANOG和SSEA-4等多能性標(biāo)志物進行iPSCs的免疫染色,結(jié)果均現(xiàn)陽性(圖2D),為了檢測iPSCs的干性,選取OCT4和SOX2為檢測基因,分別對三組細(xì)胞株進行qPCR實驗,結(jié)果如圖2E所示,三組細(xì)胞與皮膚成纖維細(xì)胞相比,均表現(xiàn)出較強的細(xì)胞干性。為了防止病人組的iPSCs在重編程過程中產(chǎn)生其他基因改變,分別對病人組iPSCs的三個克隆進行了核型分析,結(jié)果均顯示正常(圖2F)。為了更為準(zhǔn)確和嚴(yán)格的確定疾病表型,對病人組和對照組的iPSCs進行C1853T(T618I)位點的檢測,檢測結(jié)果顯示只有病人組iPSCs帶有特異位點突變(圖2G)。3.3 SQTs校正組i PS細(xì)胞株的建立及其鑒定

為了避免對照組和病人組的細(xì)胞間存在基因表型的差異,保證更為精準(zhǔn)的實驗和疾病表型分析,本課題應(yīng)用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)在SQTs病人組iPSCs水平上對T618I突變位點進行校正,以WT序列和同源序列(homology arms,HA)為模版(圖3A),通過Puromycin篩選和Spe I酶切鑒定,初步獲得了12個陽性克隆(圖3B、D),再通過后續(xù)的PCR實驗和特定位點的基因鑒定,獲得了3個陽性克隆:Clone#15,Clone#20,Clone#33(圖3C-D)。隨后,對獲得的校正細(xì)胞株進行了相關(guān)鑒定試驗,校正組iPSCs有典型的干細(xì)胞形態(tài)(圖3E)和AP活性(圖3F),同時使用多能性標(biāo)志物染色呈現(xiàn)陽性結(jié)果(圖3G),最后對特定基因進行qPCR檢測干性相關(guān)基因活性,結(jié)果也與對照組和病人組的檢測結(jié)果相吻合(圖2E)。3.4 心肌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)研究


本文編號：3451623