第一部分體外制備鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄活化因子目的：合成與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的啟動(dòng)子結(jié)合的鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄活化因子（ZFP-ATF）.方法：利用鋅指蛋白（ZFP）軟件工具根據(jù)VEGF啟動(dòng)子序列合成ZFP結(jié)合區(qū),通過(guò)基因克隆實(shí)驗(yàn)將合成的ZFP結(jié)合區(qū)及P65激活區(qū)的目的基因克隆到PVAX1質(zhì)粒中,采用雙酶切及DNA測(cè)序方法進(jìn)行目的基因檢測(cè)。結(jié)果：ZFP軟件合成的ZFP含有6個(gè)鋅指基序,酶切方法證實(shí)克隆構(gòu)建的位點(diǎn)在BamHl和Xholl間。測(cè)序的目的基因的長(zhǎng)度是1100bP,PVAX1是3.0KB。結(jié)論：成功合成了PVAX1-ZFP-P65質(zhì)粒；ZFP-ATF結(jié)構(gòu)包括DNA的特異性結(jié)合區(qū)及轉(zhuǎn)錄激活區(qū),可以特異性的與VEGF啟動(dòng)子結(jié)合并激活內(nèi)源性VEGF基因表達(dá)。第二部分體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ZFP-ATF對(duì)VEGF的作用目的：在體外細(xì)胞水平檢測(cè)ZFP-ATF對(duì)VEGF基因的作用。方法：通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法將ZFP-ATF、VEGF165轉(zhuǎn)染入Hy926細(xì)胞內(nèi),之后檢測(cè)VEGF剪接體形式及蛋白的相對(duì)表達(dá)濃度。結(jié)果：ZFP-ATF主要促進(jìn)VEGF的主要三種剪接體形式的產(chǎn)生,同時(shí)VEGF的蛋白相對(duì)濃度要顯著高... 

【文章來(lái)源】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院北京市 211工程院校 985工程院校

【文章頁(yè)數(shù)】：125 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
縮略詞表
中文摘要
Abstract
前言
    參考文獻(xiàn)
第一部分 鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄活化因子的制備
    引言
    一 材料與儀器
    二 實(shí)驗(yàn)方法
        (一) 人工合成鋅指蛋白目的基因和靶基因的結(jié)構(gòu)合成
        (二) 基因克隆
            1. 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)實(shí)驗(yàn)
            2. PCR產(chǎn)物回收
            3. 質(zhì)粒與合成的鋅指蛋白目的DNA片段的連接
            4. 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備
            5. 轉(zhuǎn)化與篩選
            6. 取PCR陽(yáng)性的LB菌液進(jìn)行保菌
            7. 質(zhì)粒提取：取PCR陽(yáng)性的LB管進(jìn)行小質(zhì)粒提取
            8. 酶切鑒定質(zhì)粒中的插入片斷
        (三) 將PVAX1-ZFP質(zhì)粒與PcDNA3.0-P65質(zhì)粒進(jìn)行重組構(gòu)成PVAX1-ZFP-P65質(zhì)粒
    三 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        1 合成鋅指蛋白的氨基酸序列
        2 合成鋅指蛋白的結(jié)構(gòu)組成
        3 質(zhì)粒的酶切電泳圖
    四 討論
        一 鋅指蛋白的轉(zhuǎn)錄作用
        二 人工合成鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子
        三 VEGF基因作用
    參考文獻(xiàn)
第二部分 ZFP-ATF在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中的研究
    引言
    一 實(shí)驗(yàn)材料及試劑
    二 實(shí)驗(yàn)方法
        1. Hy926細(xì)胞株的培養(yǎng)
            1.1 細(xì)胞復(fù)蘇
            1.2 細(xì)胞傳代
        2. 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入Hy926細(xì)胞內(nèi)
        3 細(xì)胞總RNA提取(TkIzol法)
        4 RT-PCR檢測(cè)VEGF不同剪接體基因的表達(dá)
        5 細(xì)胞內(nèi)蛋白提取
        6 蛋白濃度測(cè)定和Western-Blotting
    三 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        1 細(xì)胞形態(tài)
        2 R-T PCR結(jié)果
        3 Western Blot結(jié)果
    四 討論
        一 VEGF基因的信號(hào)傳導(dǎo)
        二 VEGF基因的不同剪接體的生成及作用
    參考文獻(xiàn)
第三部分 大鼠腸系膜血管實(shí)驗(yàn)
    引言
    一 實(shí)驗(yàn)材料
    二 實(shí)驗(yàn)步驟
        (一) SD大鼠的飼養(yǎng)
        (二) 大鼠腸系膜血管增生實(shí)驗(yàn)
        (三) 大鼠腸系膜免疫熒光實(shí)驗(yàn)
    三 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        (一) 腸系膜血管計(jì)數(shù)
        (二) 腸系膜免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    四 討論
        一 腸系膜血管床的特點(diǎn)
        二 血管的滲透性研究
        三 ZFP-ATF促進(jìn)血管穩(wěn)定性的研究
    參考文獻(xiàn)
第四部分 在構(gòu)建小鼠缺血模型后PLGA優(yōu)化載體以及ZFP-ATF在小鼠下肢缺血中的治療性血管生成作用及對(duì)骨骼肌肌纖維類型研究
    引言
    一 實(shí)驗(yàn)材料
    二 實(shí)驗(yàn)方法
        (一) 小鼠下肢缺血模型建立
        (二) PLGA納米粒子優(yōu)化載體的構(gòu)建
        (三) 實(shí)驗(yàn)小鼠的分組及治療
        (四) 小鼠缺血側(cè)肌肉標(biāo)本的處理
            1, 小鼠骨骼肌肌肉重量的檢測(cè)
            2, Western Blot實(shí)驗(yàn)
            3, 染色組織學(xué)形態(tài)觀察,免疫組化
            4 在注入質(zhì)粒后的7,14天分別對(duì)小鼠缺血下肢進(jìn)行評(píng)分
        (五) 骨骼肌肌纖維類型研究
            1, 組織RNA提取和Real-time PCR
            2, 冰凍切片行肌纖維ATP酶染色
    三 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        (一) 小鼠缺血模型構(gòu)建結(jié)果
        (二) PLGA納米優(yōu)化載體的構(gòu)建
        (三) 下肢肌肉的重量測(cè)量
        (四) Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        (五) 肌肉組織化學(xué)染色
        (六) 下肢缺血肢體的功能評(píng)估
        (七) MHC Real-time PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        (八) 骨骼肌肌纖維ATP酶染色
    四 討論
        一 缺血后的血管生成
            1.1 缺血后VEGF表達(dá)限制性
            1.2 ZFP-ATF在缺血治療中的優(yōu)勢(shì)
        二 肌纖維的研究
            2.1 骨骼肌肌纖維分類及功能
            2.2 缺血后骨骼肌肌纖維轉(zhuǎn)變
            2.3 基因治療后骨骼肌肌纖維的轉(zhuǎn)變
    參考文獻(xiàn)
綜述
    參考文獻(xiàn)
個(gè)人情況
發(fā)表文章
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]轉(zhuǎn)染VEGF165基因的自體成肌細(xì)胞治療心肌梗死的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 莊煒,李莉,章慶春,林國(guó)強(qiáng),鄧震宇.  中南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版). 2012(07)
[2]The C2H2 -type Zinc Finger Protein ZFP182 is Involved in Abscisic Acid-Induced Antioxidant Defense in Rice[J]. Hong Zhang 1,2 , Lan Ni 1,2 , Yanpei Liu 1,2 , Yunfei Wang 1,2 , Aying Zhang 1,2 , Mingpu Tan 1,2 and Mingyi Jiang 1,2 1 College of Life Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China 2 National Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China.  Journal of Integrative Plant Biology. 2012(07)
[3]水稻C2H2型鋅指蛋白基因RZF71的克隆與表達(dá)分析[J]. 郭書巧,黃驥,江燕,張紅生.  遺傳. 2007(05)
[4]血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子抗體靶向血管治療對(duì)增生性瘢痕Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)的影響[J]. 岳毅剛,蔣常文,李佩英,周思.  中華燒傷雜志. 2006(06)
[5]VEGF啟動(dòng)子介導(dǎo)雙自殺基因重組腺病毒對(duì)LoVo細(xì)胞的體外殺傷作用[J]. 黃宗海,陳建雄,蘇國(guó)強(qiáng).  第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào). 2005(05)
[6]應(yīng)用AdEasier-1系統(tǒng)高效制備含VEGFP驅(qū)動(dòng)TK自殺基因的重組腺病毒[J]. 陳建發(fā),黃宗海,黃元媛,宋慧娟,車小燕.  癌癥. 2004(09)
[7]下咽癌腫瘤及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中VEGF、PDGF和MVD的表達(dá)及意義[J]. 董頻,宮鳩義己,中島格.  臨床耳鼻咽喉科雜志. 2002(09)
[8]帶信號(hào)肽人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子基因VEGF121及VEGF165載體的克隆[J]. 周忠江,劉伊麗,吳平生,李小衛(wèi),查道剛,周穎.  第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào). 2002(02)



本文編號(hào)：3434723