組織因子（TF）作為凝血途徑的始動(dòng)因子以為人所熟知。在血管損傷后,TF和凝血因子Ⅶa （FVIIa）形成復(fù)合物激活凝血蛋白酶的瀑布反應(yīng),導(dǎo)致纖維蛋白沉積和血小板的活化。另外,在許多疾病如敗血癥,動(dòng)脈粥樣硬化和腫瘤,血管中TF的異常表達(dá)會(huì)引起致命的血栓形成。近年來(lái)研究表明,血管中的TF在產(chǎn)生凝血蛋白酶和后續(xù)激活蛋白酶激活受體（PARS）中也發(fā)揮著非止血作用。這些TF依賴(lài)性的信號(hào)通路促進(jìn)了一系列生物進(jìn)程,包括炎癥,腫瘤轉(zhuǎn)移和細(xì)胞遷移。本課題組前期研究的EGFP-EGF1蛋白具有TF特異性和高度的親和力,且將其連接于聚乙二醇—聚乳酸—聚羥基乙酸納米粒（PLGA）納米粒表面后構(gòu)建的EGFP-EGF1-PLGA納米粒也具有TF靶向性。小干擾RNAs （siRNA）通過(guò)完全互補(bǔ)的RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）介導(dǎo)特異性切割,并有針對(duì)性的破壞靶基因的mRNA,從而產(chǎn)生靶基因的mRNA序列特異基因沉默效應(yīng)。它們己被證明能有效下調(diào)人類(lèi)細(xì)胞中的基因表達(dá),從而具有治療疾病的潛力。然而,siRNA分子本身帶負(fù)電荷,易于被血清中的核酸酶降解,容易被腎臟清除,并無(wú)靶向分布能力,這些都導(dǎo)致它難以到達(dá)作用的靶細(xì)胞。... 

【文章來(lái)源】：華中科技大學(xué)湖北省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：138 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
前言
第一部分 載組織因子siRNA的EGFP-EGF1蛋白結(jié)合聚乙二醇—聚乳酸—聚羥基乙酸納米粒的構(gòu)建及表征
    1 儀器和材料
        1.1 儀器
        1.2 材料和試劑
    2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.1 大鼠TF-siRNA片段的篩選
        2.2 載TF-siRNA的PEG-PLGA納米粒的制備
        2.3 EGFP-EGF1結(jié)合PEG-PLGA納米粒
        2.4 TF-siRNA-EGFP-EGF1-PLGA納米粒的表征
        2.5 ENP和NP載siRNA的載藥量和體外釋放
    3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.1 TF-siRNA的篩選
        3.2 載TF-siRNA的NP和ENP的表征
        3.3 TF-siRNA-ENP的免疫電鏡
        3.4 TF-siRNA-ENP的EGFP-EGF1蛋白連接效率
        3.5 載TF-siRNA納米粒的載藥量及包封率
        3.6 TF-siRNA-ENP的體外釋放
    4 討論
第二部分 載組織因子siRNA的EGFP-EGF1蛋白結(jié)合聚乙二醇—聚乳酸—聚羥基乙酸納米粒的靶向性及體外評(píng)價(jià)
    1 儀器和材料
        1.1 儀器
        1.2 材料和試劑
        1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
    2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.1 大鼠BMECs原代細(xì)胞培養(yǎng)鑒定及體外損傷模型的建立和鑒定
        2.2 載TF-siRNA和香豆素-6的ENP和NP的制備
        2.3 香豆素-6體外HPLC分析方法的建立
        2.4 比濁法測(cè)定載香豆素-6納米粒的濃度
        2.5 香豆素-6的載藥量和包封率
        2.6 大鼠BMECs對(duì)載siRNA和香豆素-6的ENP的攝取及siRNA的示蹤
        2.7 TF-siRNA-ENP對(duì)BMECs的毒性評(píng)價(jià)
        2.8 TF-siRNA-ENP對(duì)損傷BMECs的TF mRNA的影響
        2.9 TF-siRNA-ENP對(duì)損傷BMECs的TF蛋白表達(dá)的影響
        2.10 TF-siRNA-ENP對(duì)損傷BMECs表達(dá)TF活性的影響
    3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.1 大鼠BMECs原代細(xì)胞免疫熒光鑒定
        3.2 香豆素-6體外HPLC分析方法的建立
        3.3 香豆素-6的載藥量和包封率
        3.4 大鼠BMECs對(duì)載siRNA和香豆素-6的ENP和NP的攝取和siRNA的示蹤
        3.5 TF-siRNA-ENP的體外毒性評(píng)價(jià)
        3.6 TF-siRNA-ENP對(duì)損傷BMECs表達(dá)TF mRNA的影響
        3.7 TF-siRNA-ENP對(duì)損傷BMECs的TF蛋白表達(dá)的影響
        3.8 TF-siRNA-ENP對(duì)損傷BMECs表達(dá)TF活性的影響
    4 討論
第三部分 EGFP-EGF1蛋白結(jié)合聚乙二醇—聚乳酸—聚羥基乙酸納米粒在動(dòng)脈粥樣硬化模型中靶向性的研究
    1 儀器和材料
        1.1 儀器
        1.2 材料和試劑
        1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
    2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.1 小鼠VSMCs的原代培養(yǎng)和鑒定
        2.2 高表達(dá)TF的細(xì)胞模型的建立及鑒定
        2.3 載Dir納米粒的合成和鑒定
        2.4 載香豆素-6納米粒的細(xì)胞攝取
        2.5 小鼠AS模型的建立和鑒定
        2.6 Dir-ENP在AS模型小鼠體內(nèi)組織分布
    3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.1 小鼠原代VSMCs的鑒定
        3.2 體外高表達(dá)TF細(xì)胞模型的鑒定
        3.3 Dir載藥量的測(cè)定
        3.4 載香豆素-6納米粒的細(xì)胞攝取
        3.5 小鼠AS模型的鑒定
        3.6 Dir-ENP在AS模型小鼠體內(nèi)組織分布
    4 討論
第四部分 載CCR2-shRNA的EGFP-EGF1蛋白結(jié)合聚乙二醇—聚乳酸—聚羥基乙酸納米粒的體外研究
    1 儀器和材料
        1.1 儀器
        1.2 材料和試劑
        1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
    2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.1 AS模型小鼠主動(dòng)脈中TF和CCR2表達(dá)的鑒定
        2.2 體外表達(dá)TF和CCR2細(xì)胞模型的建立及鑒定
        2.3 CCR2-shRNA的質(zhì)粒提取
        2.4 載CCR2-shRNA納米粒的制備
        2.5 CCR2-shRNA-ENP的體外毒性研究
        2.6 CCR2-shRNA-ENP對(duì)細(xì)胞模型CCR2表達(dá)的影響
        2.7 CCR2-shRNA-ENP對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響
    3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.1 AS模型小鼠主動(dòng)脈中TF和CCR2表達(dá)的鑒定
        3.2 體外表達(dá)TF和CCR2細(xì)胞模型的鑒定
        3.3 CCR2-shRNA-ENP的體外毒性
        3.4 CCR2-shRNA-ENP對(duì)細(xì)胞模型CCR2表達(dá)的影響
        3.5 CCR2-shRNA-ENP對(duì)細(xì)胞遷移的影響
    4 討論
參考文獻(xiàn)
全文總結(jié)
綜述
    參考文獻(xiàn)
英文縮寫(xiě)對(duì)照
致謝
附錄一 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文目錄
附錄二 攻讀學(xué)位期間參與課題和會(huì)議


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]大鼠凝血因子Ⅶ EGFP-EGF1融合蛋白的表達(dá)及其結(jié)合功能初步研究[J]. 梅恒,胡豫,張迎紅,王華芳,方峻,郭濤,魏文寧.  中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志. 2008(01)



本文編號(hào)：3329482