本文關(guān)鍵詞：SUMOylation對(duì)衰老心肌TFEB生物學(xué)作用及自噬的影響，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景:現(xiàn)代醫(yī)學(xué)證明,隨著衰老,心血管疾病的發(fā)生率逐年上升。據(jù)美國(guó)心臟病協(xié)會(huì)(AHA)2015年數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示,首發(fā)心血管事件平均發(fā)生率在80歲人群較40歲人群高約25倍,且在65歲以上人群中心臟病位列致死原因首位。臨床和基礎(chǔ)研究都證實(shí),老年心肌對(duì)各種損傷(如缺血)的耐受能力顯著減退且機(jī)制仍不明確。探索衰老心肌缺血易損的具體機(jī)制,提出針對(duì)性的老年心肌保護(hù)措施具有重要意義。心肌細(xì)胞作為終末細(xì)胞,細(xì)胞內(nèi)異常事件的處理主要依靠細(xì)胞內(nèi)自身途徑。因此,蛋白質(zhì)性能和細(xì)胞器質(zhì)量的控制對(duì)于心肌意義重大。自噬在心肌細(xì)胞器轉(zhuǎn)歸(如受損的線粒體)和紊亂蛋白聚集物降解中發(fā)揮關(guān)鍵作用。老年個(gè)體心臟功能紊亂、抗損傷能力降低與衰老心肌自噬能力減退密切相關(guān)。與之對(duì)應(yīng),上調(diào)基礎(chǔ)狀態(tài)下心肌自噬水平有助于保護(hù)衰老心肌,對(duì)抗不可逆性損傷。細(xì)胞自噬能力受多種因素調(diào)控,最新發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄因子EB(TFEB)是介導(dǎo)自噬相關(guān)蛋白轉(zhuǎn)錄的重要調(diào)控分子。TFEB是MIT/TFE轉(zhuǎn)錄因子家族的成員之一,靜息狀態(tài)下,TFEB定位于細(xì)胞質(zhì)中,當(dāng)細(xì)胞遭受饑餓或應(yīng)激后,TFEB轉(zhuǎn)入細(xì)胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性調(diào)控細(xì)胞自噬水平。TFEB對(duì)細(xì)胞自噬的誘導(dǎo),融合,降解的全過(guò)程發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。更為重要的,TFEB本身的轉(zhuǎn)錄活性受到翻譯后修飾的調(diào)控。已有的體外實(shí)驗(yàn)證實(shí),MAPK家族的ERK可對(duì)TFEB進(jìn)行磷酸化修飾調(diào)節(jié)其核轉(zhuǎn)位。但是,TFEB在細(xì)胞核內(nèi)還會(huì)發(fā)生什么樣的翻譯后修飾?這種修飾對(duì)TFEB穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性有何影響?特別是,衰老心肌細(xì)胞核內(nèi)TFEB的翻譯后修飾仍屬未知。針對(duì)心肌細(xì)胞核內(nèi)TFEB翻譯后修飾進(jìn)行干預(yù)是衰老心肌自噬調(diào)控的新內(nèi)容。SUMOylation(小泛素相關(guān)修飾物,Small Ubiquitin-like Modifier,SUMO)作為一種重要的翻譯后修飾方式對(duì)蛋白質(zhì)的功能有廣泛的調(diào)節(jié)作用,主要包括調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的細(xì)胞定位,蛋白質(zhì)之間的相互作用以及蛋白質(zhì)的活性等方面。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn),SUMO化修飾涉及多種生物學(xué)過(guò)程中的大量蛋白質(zhì),是心臟發(fā)育和功能完整的關(guān)鍵性調(diào)控事件。也有研究顯示,SUMO化修飾異常與衰老心肌抗損傷能力減弱密切相關(guān)。SUMOylation的底物蛋白多位于細(xì)胞核內(nèi),且含有ψKXE模塊序列(ψ:疏水氨基酸;K:賴氨酸,X:任意氨基酸)。我們采用SUMOplot分析程序發(fā)現(xiàn)TFEB在K348位點(diǎn)具有SUMOylation所必須的ψKXE模塊序列(347VKQE350)。因此,本研究旨在探討衰老心肌自噬功能障礙過(guò)程中SUMOylation發(fā)揮什么樣的作用?SUMOylation是否與自噬調(diào)控的關(guān)鍵分子TFEB存在生物學(xué)聯(lián)系?研究目的:1,明確心肌細(xì)胞核內(nèi)SUMO化修飾對(duì)TFEB自噬調(diào)控的影響;2,證實(shí)TFEB-SUMO化修飾減退是否參與衰老心肌自噬功能障礙;3,明確干預(yù)TFEB-SUMO化修飾能否改善衰老心肌自噬功能發(fā)揮心肌保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)方法:本實(shí)驗(yàn)采用成年(4-6月齡)及老年(22-24月齡)雄性C57BL/6小鼠,提取組織蛋白,通過(guò)免疫共沉淀方法檢測(cè)TFEB與SUMO1分子間作用,蛋白免疫印跡、實(shí)時(shí)定量PCR等方法檢測(cè)TFEB,SUMO1,自噬相關(guān)蛋白LC3、Atg5、Beclin1及溶酶體相關(guān)蛋白LAMP1等分子的表達(dá)水平。采用小劑量雷帕霉素(0.25 mg/kg)處理成年及老年小鼠8周,檢測(cè)上述分子變化。采用重組腺相關(guān)病毒9型(r AAV9)為載體在體抑制成年小鼠或過(guò)表達(dá)老年小鼠心肌SUMO1,腺病毒為載體抑制心肌TFEB,并構(gòu)建心肌缺血/再灌注模型,提取組織蛋白,采用蛋白免疫印跡方法檢測(cè)TFEB,SUMO1,自噬相關(guān)蛋白LC3、Atg5、Beclin1及溶酶體相關(guān)蛋白LAMP1等分子的表達(dá)水平,TUNEL染色、伊文氏藍(lán)-TTC雙染色檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡及梗死面積。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1,采用免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),80k D的細(xì)胞核TFEB與SUMO1結(jié)合,發(fā)生了SUMOylation修飾;而68k D的胞漿TFEB并沒(méi)有與SUMO1結(jié)合。結(jié)果證實(shí):心肌TFEB可以被SUMO化修飾(SUMOylated TFEB),且主要發(fā)生在細(xì)胞核內(nèi)。2,衰老心肌中TFEB水平較成年心肌顯著降低。并且,對(duì)比成年心肌,衰老心2,衰老心肌中TFEB水平較成年心肌顯著降低。并且,對(duì)比成年心肌,衰老心肌細(xì)胞核中SUMO化修飾的TFEB水平顯著減退(P0.05,n=5)。3,與成年心肌相比,衰老心肌自噬功能顯著減退,表現(xiàn)為:自噬誘導(dǎo)因子LC3,beclin-1,Atg5表達(dá)減退;溶酶體蛋白LAMP2表達(dá)減退;自噬底物蛋白p62顯著增加。4,在成年組,小劑量雷帕霉素處理可有效促進(jìn)TFEB入核,提高核內(nèi)TFEB水平并增強(qiáng)自噬。但是,對(duì)老年C57小鼠在體給予小劑量雷帕霉素處理,以成年C57小鼠為對(duì)照,我們發(fā)現(xiàn),雖然雷帕霉素顯著增加了成年心肌細(xì)胞核中TFEB水平,而老年小鼠心肌細(xì)胞核中TFEB水平并沒(méi)有顯著提高。為了明確TFEB的SUMOylation修飾和心肌自噬轉(zhuǎn)錄調(diào)控之間的聯(lián)系,采用r AAV9為載體在體給予sh-SUMO1干預(yù),利用r AAV9的親心肌特性成功實(shí)現(xiàn)心肌SUMO1的敲低。重要的結(jié)果顯示,隨著SUMO1的敲低,心肌細(xì)胞核內(nèi)TFEB水平隨之減退(P0.05,n=5)。并且,受TFEB調(diào)控的自噬相關(guān)蛋白LC3,LAMP2也被抑制。該結(jié)果提示,SUMO化修飾是心肌細(xì)胞核內(nèi)TFEB保持蛋白穩(wěn)定和轉(zhuǎn)錄活性的重要條件。5,反之,采用rAAV9為載體在體心肌過(guò)表達(dá)SUMO1水平,可顯著改善衰老心肌細(xì)胞核內(nèi)TFEB蛋白水平,并隨之增強(qiáng)自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。6,采用sh RNA抑制TFEB表達(dá)后,SUMO1上調(diào)所引起的自噬增加效應(yīng)隨之消失,表現(xiàn)為L(zhǎng)C3、LAMP1表達(dá)均明顯下調(diào)。證實(shí)TFEB的SUMO修飾是衰老心肌自噬調(diào)控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。7,在上述基礎(chǔ)上,通過(guò)調(diào)節(jié)TFEB的SUMO化修飾水平改善衰老心肌基礎(chǔ)自噬水平可顯著改善衰老心肌抗缺血損傷能力,減少心肌梗死面積和心肌細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)結(jié)論:1,本研究證明了細(xì)胞核的SUMO化修飾TFEB調(diào)控心肌細(xì)胞自噬,并證明心肌細(xì)胞核內(nèi)的TFEB-SUMO化修飾功能減退是衰老心肌基礎(chǔ)自噬功能障礙的重要機(jī)制。因此改善TFEB的SUMO化水平是提高衰老心肌自噬能力的有效手段。2,通過(guò)調(diào)節(jié)TFEB-SUMO化修飾水平改善衰老心肌基礎(chǔ)自噬最終可減輕衰老心肌缺血后損傷,實(shí)現(xiàn)心肌保護(hù)。
【關(guān)鍵詞】：衰老心肌 自噬 轉(zhuǎn)錄因子EB 類泛素相關(guān)修飾 缺血損傷
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R54
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表4-7
• 中文摘要7-11
• 英文摘要11-15
• 前言15-17
• 文獻(xiàn)回顧17-31
• 第一部分 衰老心肌TFEB的SUMO化修飾異常及自噬功能減退31-46
• 1 材料31-33
• 2 方法33-38
• 3 結(jié)果38-44
• 4 討論44-46
• 第二部分 干預(yù)心肌TFEB-SUMO化修飾改善衰老心肌自噬衰退46-55
• 1 材料46-48
• 2 方法48-49
• 3 結(jié)果49-53
• 4 討論53-55
• 第三部分TFEB-SUMO化修飾是改善衰老心肌抗缺血損傷能力的新靶點(diǎn)55-63
• 1 材料55-56
• 2 方法56-58
• 3 結(jié)果58-61
• 4 討論61-63
• 小結(jié)63-64
• 參考文獻(xiàn)64-71
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷和研究成果71-73
• 致謝73

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1 張樂(lè);SUMOylation對(duì)衰老心肌TFEB生物學(xué)作用及自噬的影響[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2015年

  本文關(guān)鍵詞：SUMOylation對(duì)衰老心肌TFEB生物學(xué)作用及自噬的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：329861