目的:凋亡反應(yīng)是心肌缺血再灌注損傷（MI/RI）的關(guān)鍵環(huán)節(jié),抑制心肌細(xì)胞凋亡可有效減輕MI/RI,本實(shí)驗(yàn)擬通過mi R-327重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染H9C2心肌細(xì)胞與大鼠心肌組織,研究mi R-327對MI/RI誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的作用,并進(jìn)一步探討其通過調(diào)控凋亡抑制因子（ARC）等相關(guān)信號通路對MI/RI的影響,為防治MI/RI提供理論依據(jù)和新的治療靶點(diǎn)。方法:（1）細(xì)胞實(shí)驗(yàn):培養(yǎng)H9C2大鼠心肌細(xì)胞,隨機(jī)分成5組:空白對照組（control組）,缺氧復(fù)氧組（H/R組）、腺病毒空載組（Ad-EGFP-NC+H/R,Ad-NC組）、mi R-327上調(diào)組（Ad-mi R-327+H/R,Ad-mi R-327組）、mi R-327下調(diào)組（Ad-mi R-327-RNAi+H/R,Ad-mi R-327i組）。將重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染H9C2心肌細(xì)胞48 h后,建立心肌缺氧復(fù)氧（H/R）損傷模型（缺氧4 h,復(fù)氧12 h）。采用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀測定腺病毒轉(zhuǎn)染效率;CCK-8法檢測細(xì)胞存活率;全自動生化分析儀檢測培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶（LDH）釋放水平;流式細(xì)胞儀檢測凋亡率;實(shí)時熒光定量PCR（... 

【文章來源】：三峽大學(xué)湖北省

【文章頁數(shù)】：53 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

缺氧復(fù)氧刺激后H9C2細(xì)胞miR-327及ARC表達(dá)變化

將Ad-miR-327按不同MOI值轉(zhuǎn)染至H9C2細(xì)胞48 h后胞漿中出現(xiàn)綠色熒光蛋白的表達(dá),流式細(xì)胞儀上可見相應(yīng)的峰值及陽性百分比(圖3A)。結(jié)果提示,隨著MOI值上升,GFP表達(dá)增多,MOI=50時轉(zhuǎn)染效率為86.46%,與MOI=25相比,其轉(zhuǎn)染效率顯著提高(P<0.05)(圖3B)。同時采用CCK-8檢測不同MOI值下心肌細(xì)胞存活率,進(jìn)而確認(rèn)腺病毒轉(zhuǎn)染H9C2細(xì)胞的最佳MOI值。如圖3C所示,與MOI=0相比,MOI=100和MOI=150其細(xì)胞存活率明顯下降(P<0.05)。因此,選擇MOI=50作為最佳感染復(fù)數(shù)。1.3 miR-327 下調(diào)可抑制 H/R 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷及凋亡

此外,流式細(xì)胞術(shù)以及Western blot檢測cleaved Caspase-3表達(dá)結(jié)果提示(圖4D-E),H/R刺激可明顯增加心肌細(xì)胞凋亡以及cleaved Caspase-3表達(dá)。與Ad-NC組相比,Ad-miR-327i組凋亡細(xì)胞數(shù)與cleaved Caspase-3表達(dá)明顯減少,而Ad-miR-327組凋亡細(xì)胞數(shù)與cleaved Caspase-3表達(dá)明顯增加(P<0.05)。上述指標(biāo)中,Ad-NC組與H/R相比均無明顯差異(P>0.05)。以上結(jié)果提示,miR-327下調(diào)可抑制H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷及凋亡反應(yīng)。1.4 miR-327 下調(diào)可抑制 H/R 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
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