研究背景缺血缺氧是心肌最常見的損害因素之一,嚴(yán)重?zé)齻颊咴缙?心肌也存在缺血缺氧損害。缺血缺氧可調(diào)控心肌細(xì)胞自噬水平,但自噬對心肌損害的作用一直備受爭議。目前認(rèn)為自噬-溶酶體通路（autophagic-lysosomal pathway,ALP）障礙導(dǎo)致的自噬流受損是介導(dǎo)細(xì)胞損傷的重要因素。但自噬流受損介導(dǎo)細(xì)胞損傷的具體機(jī)制尚不清楚。自噬流受損可表現(xiàn)為自噬底物堆積,溶酶體體積增大,使溶酶體更易受到外界因素的損害。溶酶體膜損傷主要表現(xiàn)為溶酶體膜通透化（lysosomal membrane permeabilization,LMP）,伴隨溶酶體內(nèi)容物包括質(zhì)子及多種水解酶的漏出,導(dǎo)致胞漿酸化,介導(dǎo)凋亡、壞死等多種細(xì)胞死亡。既往研究提示,心肌缺血導(dǎo)致溶酶體水解酶分布異常及活性改變。但心肌缺血損傷中是否發(fā)生LMP缺乏確切證據(jù),LMP對心肌細(xì)胞損傷的調(diào)控尚不清楚。溶酶體功能障礙是導(dǎo)致自噬流受損的重要機(jī)制,也是多種疾病的重要致病因素。近年來發(fā)現(xiàn),在異丙腎上腺素注射構(gòu)建的心肌梗死模型中也存在溶酶體功能障礙。調(diào)控溶酶體功能的分子包括溶酶體水解酶、溶酶體膜相關(guān)蛋白以及參與溶酶體成分分選、運(yùn)輸及翻譯后修飾的... 

【文章來源】：中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)重慶市

【文章頁數(shù)】：119 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

AO釋放實(shí)驗(yàn)檢測缺血缺氧對心肌細(xì)胞LMP的影響

陸軍軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文31圖2.2Gal3免疫熒光染色檢測缺血缺氧對心肌細(xì)胞LMP的影響A.常氧組及缺血缺氧組心肌細(xì)胞Gal3和Lamp1免疫熒光染色；B.圖A中單位面積Gal3熒光強(qiáng)度的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)結(jié)果，―*‖代表相對于常氧組p<0.05。溶酶體膜損傷可導(dǎo)致溶酶體水解酶漏出至胞漿中裂解胞漿中的重要分子，引起細(xì)胞損傷甚至細(xì)胞死亡。CatB及CatD（cathepsinD）是溶酶體內(nèi)重要的組織蛋白酶，也是與溶酶體相關(guān)的細(xì)胞死亡關(guān)系最為密切的兩種水解酶。因此，接下來我們采用digitonin提取不含溶酶體成分的胞漿成分，通過檢測胞漿中CatB的活性反映溶酶體水解酶向胞漿漏出的情況[62,63]。依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，我們采用不同濃度（0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、200ug/ml）digitonin溶液提取胞漿成分，檢測胞漿CatB的活性及LDH水平，判斷提取不含溶酶體的胞漿成分的最佳digitonin濃度。我們發(fā)現(xiàn)digitonin溶液濃度在15-20ug/ml之間時，LDH基本達(dá)到最大水平（圖2.3），此時細(xì)胞膜完全通透，但溶酶體膜尚未被破壞。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，我們選取的digitonin濃度為17ug/ml。

陸軍軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文32圖2.3digitonin最佳濃度篩選用17ug/mldigitonin提取不含溶酶體的胞漿成分，檢測胞漿中CatB的活性。實(shí)驗(yàn)分為對照組、缺血缺氧處理3h、6h、9h組。我們發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞缺血缺氧處理3h，胞漿中CatB活性顯著增強(qiáng)，隨著處理時間的延長，胞漿中CatB活性逐漸增高（圖2.4）。上述3種方法共同說明，缺血缺氧引起心肌細(xì)胞LMP，導(dǎo)致溶酶體內(nèi)水解酶漏出至胞漿中。由于CatB在胞漿中性環(huán)境仍具有活性，因此LMP可能是介導(dǎo)缺血缺氧心肌細(xì)胞損傷的重要因素。圖2.4digitonin提取法檢測胞漿中CatB活性常氧組及缺血缺氧3h、6h、9h組胞漿CatB活性檢測統(tǒng)計(jì)結(jié)果，―**‖代表相對于常氧組p<0.01。


本文編號：3279381