目的：研究鈉通道β1亞基新的突變A197V在Brugada綜合征發(fā)病中的意義。在體外細胞系HEK293水平共轉鈉通道α亞基SCN5A與突變β1亞基,通過全細胞膜片鉗技術明確SCN1B/A197V對鈉通道電生理學特性的影響。建立基于患者特異性的誘導多能干細胞（Induced pluripotent stem cells,iPSCs）,為心肌分化、電生理研究及基因治療提供基礎。方法：1.臨床明確診斷的10例Brugada綜合征患者進行6種編碼基因的測序,以發(fā)現(xiàn)與該病相關的新的基因位點突變。2.構建基于突變的表達質(zhì)粒,并通過酶切及直接測序證明質(zhì)粒構建的成功。3.將含突變基因的質(zhì)粒轉染HEK293細胞,進行細胞免疫熒光鑒定及膜片鉗技術檢測,以明確該基因突變位點對離子通道特性的影響。4.原代培養(yǎng)患者皮膚成纖維細胞,使用Yamanaka的SKOM（SOX2、KLF4. OCT4、C-MYC）四質(zhì)粒系統(tǒng)感染皮膚成纖維細胞,在特定的培養(yǎng)條件下誘導生成基于患者特異性的iPSCs。結果:1.基因測序結果表明其中一位具有Ⅰ型Brugada綜合征心電圖的46歲患者發(fā)現(xiàn)編碼鈉通道β1亞基的SCN1B第4外顯子發(fā)... 

【文章來源】：南京醫(yī)科大學江蘇省

【文章頁數(shù)】：102 頁

【學位級別】：博士

【部分圖文】：

酶切驗證位點Figure5SiteofPstIdigestion

結果如圖B。于是我們選擇突變型M1，M3與野生型WT1，WT3進行全質(zhì)粒測序，測序引物為CMV forward固定引物。測序結果顯示突變型Ml野生型WT1,WT3含有正確插入片段，與酶切結果一致。

2重組SCN1B-PIRES2-EGFP質(zhì)粒測序驗證重組野生型及誘變型SCNlB-pIRES2-EGFP經(jīng)過測序證實含有所要求的SCN1B編碼區(qū)，其中堿基誘變結果見下圖，可見原有堿基C被T代替。


本文編號：3101741