發(fā)布時間：2021-01-22 17:47

　　目的：分離培養(yǎng)原代乳鼠心肌細胞并誘導(dǎo)其肥大,以肥大的心肌細胞模擬建立缺血后適應(yīng)模型,在此基礎(chǔ)上添加藥物干預(yù)檢測S1P/S1P1信號通路在肥大心肌細胞缺血后適應(yīng)中的作用。方法：分離培養(yǎng)原代乳鼠心肌細胞,并通過免疫熒光法對其純度進行鑒定。用去甲腎上腺素（NE）誘導(dǎo)心肌細胞肥大,通過RT-PCR檢測β-MHC和測量細胞表面積來驗證心肌細胞肥大情況并確定NE最佳濃度。用三氣培養(yǎng)箱缺氧、復(fù)氧模擬建立細胞缺血再灌注模型及缺血后適應(yīng)模型,通過TUNEL法檢測細胞形態(tài)學(xué)凋亡和AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測心肌細胞凋亡率來確定模型的建立情況并以RT-PCR檢測相關(guān)mRNA （S1P1）的表達。肥大心肌細胞在缺氧后適應(yīng)基礎(chǔ)上添加藥物干預(yù)信號通路進行相關(guān)檢測,根據(jù)添加藥物分為5組：（1）空白組,（2）S1P組,（3）W-146+S1P組,（4） PD98059+S1P組,（5） LY-294002+S1P組。通過流式檢測心肌細胞凋亡率、TUNEL法檢測心肌細胞凋亡形態(tài)、Western-blot檢測凋亡蛋白及相關(guān)信號通路蛋白（t-ERK1/2、p-ERK1/2、t-Ak、p-Akt）表達。結(jié)果：（... 

【文章來源】：新疆醫(yī)科大學(xué)新疆維吾爾自治區(qū)

【文章頁數(shù)】：58 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

h后心肌細胞形態(tài)(分別為x100,x200,x400倍)

而化組和ＩＰｏｓｔ組肥大必肌細胞中陽性著色細胞核呈綠色顆粒，細胞體??積縮小，有致密的染色質(zhì)邊集、斷裂成核碎片等改變，且ＩＰｏｓｔ組肥大必肌細胞ＴＵＮＥＬ??染色陽性細胞要明顯少于化組（圖９）。流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)化組（２７．９０％±４．４９％）??和ＩＰｏｓｔ組肥大也肌細胞（１５．９０〇／〇±１．７７％）的調(diào)亡率明顯高于Ｓｈａｍ姐肥大也肌細胞??（７．９７％±２．１８％），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（ｆ＜０．０５），而ＩＰｏｓｔ組洞亡率要明顯低于化??組（戶＜０．０５）。綜合Ｗ上結(jié)果證明，缺氧后適應(yīng)模型建立成功（圖１０，１１）。??■?■■■??Ｓｈａｍ?ＩＲ?ＩＰｏｓｔ??圖９?ＴＵＮ：ＥＬ染色鏡下各絕贓大也肌綿胞調(diào)ｔ：情況??Ｆｉｇ．９?Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ?ｏｆ?ｅａｃｈ?ｇｒｏｕｐ?ｄｅｔｅｃｔｅｄ?ｂｙ?ＴＵＮＥＬ?ｓｔａｉｎ??２２??

結(jié)果??１原代郭鼠也肌細胞的分離培養(yǎng)及鑒定??１．１也肌細胞存活率??臺盼藍染色后計數(shù)，共乂６個必肌細胞，１２個細胞染色陽性呈藍色，其余未染??色，也肌細胞細胞存活率較高，為９７％左右。??１．２也肌細胞形態(tài)及搏動情況??倒置顯微鏡下可見剛分離出的也肌細胞呈圓形，大而透亮，懸浮于培養(yǎng)液中。４??ｈ后細胞開始貼壁生長，１２?ｈ后細胞基本貼壁，開始變形，伸展為梭形、棒狀、星??狀、Ｈ角形和多邊形等形態(tài)，并且細胞核大且胞漿豐富，立體感明顯，折光性強。??２４?ｈ后貼壁的單個也肌細胞開始出現(xiàn)自發(fā)性的搏動，細胞間搏動頻率各有不同（圖??１）。４化后也肌細胞伸出偽足，相互之間開始形成交聯(lián)，細胞交聯(lián)后搏動的頻率同??步且明顯加快（圖２）。７化后必肌細胞開始聚集成簇，有菊形的細胞團形成，細胞??簇呈島碼樣搏動（圖３）。此方法分離培養(yǎng)的必肌細胞培養(yǎng)到第４、５ｄ細胞搏動率可??法到９〇％Ｗ上，說明也肌細胞的純度高。??

【參考文獻】：
期刊論文
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碩士論文
[1]9型腺相關(guān)病毒介導(dǎo)CaMEK基因轉(zhuǎn)染增強心肌細胞ERK1/2通路表達活性的研究[D]. 紀偉寧.新疆醫(yī)科大學(xué) 2012



本文編號：2993652