研究背景:低氧性肺動(dòng)脈高壓表現(xiàn)為持久的肺血管收縮及顯著的肺血管重構(gòu),引起肺動(dòng)脈壓力明顯增加,最終導(dǎo)致致命性的右心衰竭。以血管平滑肌細(xì)胞增殖及內(nèi)皮細(xì)胞損傷為核心的細(xì)胞增殖/凋亡失衡是血管重構(gòu)的關(guān)鍵因素。持續(xù)的低氧暴露可促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增殖,促進(jìn)血管重構(gòu)。血管內(nèi)的平滑肌細(xì)胞同時(shí)也受其他細(xì)胞調(diào)控,內(nèi)皮細(xì)胞位于血管壁的內(nèi)層,調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞增殖、血小板黏附和聚集、內(nèi)源性舒張物質(zhì)分泌等。低氧可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,激活NF-κB途經(jīng)介導(dǎo)的黏附分子及促炎細(xì)胞因子表達(dá),招募炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。同時(shí),舒張血管物質(zhì)生成減少,收縮性物質(zhì)分泌增多,進(jìn)一步加重血管重構(gòu)。線粒體不僅作為能量工廠,更是細(xì)胞內(nèi)各種信號(hào)匯集傳導(dǎo)的中轉(zhuǎn)站,廣泛參與細(xì)胞自噬,炎癥應(yīng)答,增殖/凋亡等生物進(jìn)程。低氧時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞均存在線粒體結(jié)構(gòu)和功能的異常改變。低氧可促進(jìn)平滑肌細(xì)胞糖酵解,抑制線粒體的有氧氧化。線粒體鈣水平降低是抑制線粒體有氧氧化的主要因素之一,包括丙酮酸脫氫酶、異檸檬酸脫氫酶、酮戊二酸脫氫酶和ATP合酶等線粒體呼吸相關(guān)酶的活性依賴Ca²⁺的參與。因此,線粒體鈣的減少可抑制氧化呼吸,并伴隨線粒體氧自由基的失衡。... 

【文章來源】：中國(guó)人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)重慶市

【文章頁數(shù)】：163 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

Control組和ER-mitochondrialinker組序列示意圖

2.2.10 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體連接子組及對(duì)照組線粒體呼吸檢測(cè)取 4000 個(gè)細(xì)胞接種于 Seahorse 檢測(cè) 96 孔板內(nèi)，待細(xì)胞貼壁后轉(zhuǎn)染內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體連接子和對(duì)照質(zhì)粒，次日換液，置于 21%O2繼續(xù)培養(yǎng) 48 h。測(cè)定耗氧率（oxygenconsumption rate，OCR）前日，加入 400 μL 水化液至各孔內(nèi)，置于 37°C 無 CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育過夜。次日，配制 XF-96 檢測(cè)培養(yǎng)基：加入 500 μL 谷氨酰胺（100×），500 μL丙酮酸鈉溶液，200 μL 45% D-(+)葡萄糖溶液并添加 XF-96 基礎(chǔ)培養(yǎng)基至終體積為 50mL，用 KOH 調(diào)節(jié) PH 值至 7.4。用 XF-96 檢測(cè)培養(yǎng)基稀釋寡霉素（Oligo），線粒體氧化磷酸化解偶聯(lián)劑（FCCP），魚藤酮/抗霉素 A（Rot/AA）至終濃度為 2.4 μM，0.3 μM，0.6 μM。用 XF-96 檢測(cè)培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞 2 次后，加入 175 μL XF-96 檢測(cè)培養(yǎng)基至各孔內(nèi)，置于 37°C 無 CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 1 h。依次加入各 25 μL 的 Oligo，F(xiàn)CCP，Rot/AA至藥物板內(nèi)，上機(jī)吸取藥物后加入細(xì)胞板，測(cè)定 OCR�；A(chǔ)呼吸，最大呼吸及儲(chǔ)備能力計(jì)算如圖 2-2 所示。為了比較不同的實(shí)驗(yàn)批次，實(shí)驗(yàn)組的 OCR 值以對(duì)照組的相對(duì)值計(jì)算并比較。

N48、N72 組為 21%O2培養(yǎng) 48h、72h，H48 組為 4%O2培養(yǎng) 48h，R24 組為 4%O2培養(yǎng) 48h 后，于 21%O2培養(yǎng) 24h。A：增殖相關(guān)蛋白 PCNA 的表達(dá)變化。n=4。B：凋亡相關(guān)蛋白 cleaved caspase-3的表達(dá)改變。n=3。C：Edu（綠色）標(biāo)記增殖的細(xì)胞核，Hoechst（藍(lán)色）標(biāo)記細(xì)胞核。n≧34 pictures/組。圖像標(biāo)尺=50 μm。低氧組與復(fù)氧組、對(duì)照組相比，*P <0.05; **P <0.01。2.3.2 低氧減少平滑肌細(xì)胞 MAMs 的形成通過檢測(cè)全細(xì)胞勻漿及粗提線粒體（Crude mitochondria，Mc）中 MAMs 組成蛋白IP3Rs，F(xiàn)ACL-4，VDAC1 等表達(dá)變化，探討低氧時(shí) MAMs 形成的改變[29]。如圖 2-4A、B，WB 結(jié)果表明低氧時(shí) MAMs 組成蛋白表達(dá)降低。隨后，我們通過透射電鏡觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體，測(cè)定內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體之間的最短距離以反映內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜與線粒體膜的接觸。低氧暴露后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜與線粒體外膜之間的最短距離增加（圖 2-4 C、D）。復(fù)氧后，MAMs 相關(guān)組成蛋白表達(dá)增加，最短距離減小。上述結(jié)果表明，低氧可誘導(dǎo)增殖的平滑肌細(xì)胞 MAMs 形成減少，復(fù)氧后增加。


本文編號(hào)：2989244