本文關(guān)鍵詞：硫化氫拮抗低剪切應(yīng)力致HUVECs自噬障礙及其機(jī)制，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景與目的:研究發(fā)現(xiàn),自噬具有抗動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis,As)作用。在As的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中,血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬普遍存在。當(dāng)血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬受抑制時(shí),會(huì)使血管內(nèi)皮細(xì)胞受損從而促As的發(fā)生和發(fā)展。在血管分叉處、彎曲血管內(nèi)側(cè)以及血管分支處,最容易發(fā)現(xiàn)As病灶和內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。在這些部位,血流動(dòng)力學(xué)特征有很大改變,產(chǎn)生異常剪切應(yīng)力。雖然有研究表明,高剪切應(yīng)力或低剪切應(yīng)力都能促進(jìn)As的形成。但高剪切應(yīng)力的病變條件已經(jīng)遠(yuǎn)超正常生理水平,因此眾多學(xué)者更傾向于低剪切應(yīng)力是更主要的病變因素。又有研究表明,低剪切應(yīng)力會(huì)抑止血管內(nèi)皮細(xì)胞的自噬作用。硫化氫(hydrogen sulfide,H_2S)是近年來(lái)被發(fā)現(xiàn)的第三個(gè)內(nèi)源性氣體信號(hào)分子,它具有多種生物學(xué)效應(yīng),包括抗內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、促血管生成、抗氧化以及抗As作用等。有研究表明,H_2S能夠通過(guò)AMPK途徑誘導(dǎo)保護(hù)性自噬,抑制癌變結(jié)腸上皮細(xì)胞的增殖。因此,本研究擬以AMPK為切入點(diǎn),通過(guò)建立低剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的HUVECs自噬障礙模型,探討H_2S抑制低剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的HUVECs自噬障礙的新機(jī)制。方法與結(jié)果:1、結(jié)扎小鼠左側(cè)頸總動(dòng)脈,保留較細(xì)的甲狀腺動(dòng)脈血液通路,得到血流減慢,但并未停滯的低剪切應(yīng)力血流模型,未結(jié)扎的對(duì)側(cè)為正常剪切應(yīng)力血流模型,采用免疫熒光染色法檢測(cè)H_2S合酶胱硫醚γ裂解酶(Cystathionine-γ-lyase,CSE)的蛋白表達(dá)情況。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)則分別采用正常剪切應(yīng)力(15dyne/cm~2)以及低剪切應(yīng)力(5dyne/cm~2)處理HUVECs 1小時(shí)后,用Western blot法檢測(cè)CSE的蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示,與正常處理組相比,低剪切應(yīng)力組中CSE蛋白表達(dá)水平明顯降低。這說(shuō)明在低剪切應(yīng)力作用下CSE表達(dá)被抑制,導(dǎo)致H_2S生成減少。2、分別采用正常剪切應(yīng)力(15dyne/cm~2)以及低剪切應(yīng)力(5dyne/cm~2)處理HUVECs 1小時(shí)后,用Western blot法檢測(cè)自噬標(biāo)志物L(fēng)C3、Beclin1、P62的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示低剪切應(yīng)力組LC3、Beclin 1明顯降低,自噬障礙標(biāo)志物P62明顯升高。這說(shuō)明在低剪切應(yīng)力下,HUVECs的自噬受到抑制,并發(fā)生了自噬障礙。3、不同濃度(0μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L)Na HS預(yù)處理HUVECs30min后,再采用低剪切應(yīng)力處理HUVECs1h,Western blot結(jié)果顯示,與0μmol/L組相比,H_2S可拮抗低剪切應(yīng)力處理后導(dǎo)致的細(xì)胞自噬障礙。并且這種拮抗作用呈濃度依賴性。4、將細(xì)胞隨機(jī)分為3組:正常剪切應(yīng)力(15dyne/cm~2)組,低剪切應(yīng)力(5dyne/cm~2)組,5mmol/L PPG+低剪切應(yīng)力組。其中PPG預(yù)處理細(xì)胞30min,再采用剪切應(yīng)力處理HUVECs 1h。結(jié)果表明,與低剪切應(yīng)力5dyne/cm~2組相比,PPG組細(xì)胞自噬減少。減少內(nèi)源性H_2S的生成加重低剪切應(yīng)力致HUVECs自噬減弱。5、將細(xì)胞隨機(jī)分為4組:正常剪切應(yīng)力(15dyne/cm~2)組,低剪切應(yīng)力(5dyne/cm~2)組,100μmol/L Na HS+5dyne/cm~2組,5mmol/L PPG+5dyne/cm~2組。預(yù)處理細(xì)胞30min后再采用剪切應(yīng)力處理1h。結(jié)果顯示,與正常組相比,5dyne/cm~2組與PPG+5dyne/cm~2組p-AMPK/AMPK水平下降,m TOR表達(dá)升高,Na HS+5dyne/cm~2組無(wú)明顯變化,表明補(bǔ)充外源性H_2S可拮抗低剪切應(yīng)力致AMPK失活。6、將細(xì)胞隨機(jī)分為5組,正常剪切應(yīng)力(15dyne/cm~2)組,低剪切應(yīng)力(5dyne/cm~2)組,100μmol/L Na HS+5dyne/cm~2組,AMPK抑制劑Compound C+5dyne/cm~2組,Compound C+100μmol/L Na HS+5dyne/cm~2組。預(yù)處理細(xì)胞30min后再采用剪切應(yīng)力處理1h。結(jié)果顯示,與5dyne/cm~2組相比,Na HS+5dyne/cm~2組p-AMPK/AMPK及LC3表達(dá)增高而m TOR表達(dá)降低,Compound C+5dyne/cm~2組LC3表達(dá)降低而m TOR表達(dá)升高;與Na HS+5dyne/cm~2組比較,Compound C+Na HS+5dyne/cm~2組p-AMPK/AMPK、LC3水平降低,m TOR水平升高。表明AMPK被抑制后,硫化氫拮抗低剪切應(yīng)力致自噬障礙作用被逆轉(zhuǎn)。結(jié)論:低剪切應(yīng)力可致HUVECs自噬障礙,H_2S能拮抗低剪切應(yīng)力致HUVECs自噬障礙。其機(jī)制與活化AMPK、降低細(xì)胞內(nèi)m TOR水平,增加下游通路的自噬相關(guān)蛋白表達(dá)有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：硫化氫 自噬障礙 低剪切應(yīng)力 AMPK
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R54
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-14
• 第1章 緒論14-18
• 第2章 實(shí)驗(yàn)材料與方法18-30
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器18-21
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法21-30
• 第3章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果30-40
• 3.1 不同剪切應(yīng)力作用下頸總動(dòng)脈內(nèi)膜及HUVECs CSE表達(dá)和自噬的變化30-33
• 3.2 H_2S對(duì)低剪切應(yīng)力致HUVECs自噬障礙的影響33-35
• 3.3 H_2S拮抗低剪切應(yīng)力致HUVECs自噬障礙分子機(jī)制35-40
• 第4章 討論40-44
• 第5章 結(jié)論44-45
• 參考文獻(xiàn)45-51
• 綜述 一氧化氮、一氧化碳、硫化氫三種氣體信號(hào)分子在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的“cross talk”51-63
• 參考文獻(xiàn)58-63
• 碩士期間所獲科研成果及獎(jiǎng)勵(lì)63-65
• 致謝65-66
• 課題資助66

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本文編號(hào)：296756