目的:近年來研究者對卵泡抑素樣蛋白1（FSTL1）的心臟保護作用進行了廣泛的研究,但其在心肌缺血再灌注損傷中的作用尚未完全明確,機制也不清楚。本實驗中,我們系統(tǒng)研究FSTL1預處理對心肌細胞缺血再灌注損傷的保護作用,并進一步對機制進行了探討,研究自噬通路在這一過程中的作用。方法:第一部分首先研究體外缺血再灌注損傷模型中心肌細胞的自噬變化（p62、Beclin-1和LC3II/I蛋白表達變化）,再使用自噬誘導劑雷帕霉素和自噬抑制劑3-MA進行自噬干預,并檢測干預后心肌損傷情況（CCK-8檢測細胞活性、EDU檢測細胞增殖能力、流式Annexin V/PI檢測凋亡）,明確自噬在心肌細胞缺血再灌注損傷中的作用;第二部分實驗中采用FSTL1預處理心肌細胞,再行缺血再灌注處理,檢測心肌損傷標志物CK-MB水平變化,同時CCK-8、EDU和AnnexinV/PI分別檢測FSTL1對缺血再灌注損傷心肌細胞活性、增殖和凋亡的影響;第三部分研究FSTL1預處理對于缺血再灌注損傷心肌細胞自噬（p62、Beclin-1、LC3 11/1蛋白表達以及mRFP-GFP-LC3檢測自噬流）的作用;并在FSTL1預處... 

【文章來源】：浙江大學浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數】：99 頁

【學位級別】：博士

【部分圖文】：

圖１－１?Ａ－Ｃ?Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ檢測大鼠心肌細胞Ｈ９Ｃ２在缺血缺氧再灌注前后，自噬??相關主要蛋白的變化

正文第一部分結果??Ｉ的相對表達量也明顯上調。說明缺血缺氧再灌注后，新生鼠未成熟原代心肌細胞??的自噬水平顯著提高。（圖１－２）??Ａ?Ｂ?Ｃ??＾?■?Ｃｏｎｔｒｏｌ?■?Ｃｏｎｔｒｏｌ??〇步?Ｏ?Ｈｙｐｏｘｉｃ－ｉｓｃｈｅｍｉｃ?Ｅ３?Ｈｙｐｏｘｉｃ－ｉｓｃｈｅｍｉｃ??１?２＇５ｉ?ｎ?．?３ｌ＾??＆?２．０－?ｒｉ?ｏ??ｐ６２?６２?ｋＤａ?｜?ｇ－?２－??＾?＊＊?圍?？孬［３??Ｂｅｃｌｉｎ－１?６〇?ｋＤａ?５?１分?＿?．?〇．?—??匕３?１二二誦３?ｊ?０５－?Ｉ?ｎ?Ｉ?§〇?＇?■??ＬＣ３?ＩＩ?１４?ｋＤａ?＾?〇?〇Ｊ．．．．．ＭＭ■■■＂．■—＿」■■■?｜?〇＿?Ｍ??Ｐａｃｔｉｎ?ｉ｜０ＭＰ?４３?ｋＤａ?＾?＾?？?々??°〇?＾??Ｉｍｍａｔｕｒｅ?ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ??圖１－２?Ａ－Ｃ?Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ檢測未成熟心肌細胞在缺血缺氧再灌注前后，自噬相關??主要蛋白的變化。Ｍ／＾Ｏ．Ｏｌｖｓｃｏｎｔｒｏｌ組??３．３雷帕霉素和３－ＭＡ干預在Ｈ９Ｃ２細胞ＩＲＩ中的作用??上述的實驗證實：心肌細胞在ＩＲ１后自噬明顯增強，為進一步明確自噬對于心??肌細胞的作用，我們使用自噬增強劑（雷帕霉素）和自噬抑制劑（３－ＭＡ）進行干??預，分別使用１００ｎＭ雷帕霉素或５ｍＭ３－ＭＡ預處理６ｈ后，再進行Ｉ／Ｒ處理。??３．３．１?ＣＣＫ８檢測Ｈ９Ｃ２細胞活性??用自噬抑制劑３－ＭＡ和自噬誘導劑雷帕霉素預處理Ｈ９Ｃ２細胞６ｈ后，再進行??Ｉ／Ｒ處理，檢測處理前后細胞活性變化。利用ＣＣＫ－８檢測試劑盒來檢測細胞活性，??該試劑中含有ＷＳＴ－８

?正文第？部分結果??胞活性顯著升高。（圖１－３）??１２５－．??ｔ?１００－?—：￣｜?＃??咖ｈ??Ｃｏｎｔｒｏｌ?０?Ｒａｐａ?３－ＭＡ??Ｈｙｐｏｘｉｃ－ｉｓｃｈｅｍｉｃ?２４ｈ??圖１－３?ＣＣＫ－８檢測不同條件下細胞活性的變化。０組：未給予藥物干預的ＩＲＩ??組。＊Ｐ＜０．０５雷帕霉素ｖｓＯ組；＃尸＜０．０５?３－＾１八組ｖｓＯ組。??３．３．２?ＥＤＵ檢測Ｈ９Ｃ２細胞的增殖情況??同樣用自噬抑制劑３－ＭＡ和自噬誘導劑雷帕霉素預處理Ｈ９Ｃ２細胞６ｈ，再次??缺血缺氧再灌注后，細胞增殖變化。我們采用了?ＥＤＵ試劑盒來檢測細胞增殖能力，??因ＥｄＵ是一種胸腺嘧啶核苷類似物，在細胞增殖時期代替胸腺嘧啶核苷酸滲入正??在復制的ＤＮＡ分子，因此通過檢測ＥｄＵ標記能準確地反映細胞的增殖情況。結??果：與缺血缺氧再灌注組比較，自噬抑制劑組細胞增殖顯著降低；與缺血缺氧再??灌注組比較，自噬誘導劑組細胞增殖顯著升高。（圖］－４）??１９??


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