目的:近年來研究者對卵泡抑素樣蛋白1（FSTL1）的心臟保護(hù)作用進(jìn)行了廣泛的研究,但其在心肌缺血再灌注損傷中的作用尚未完全明確,機(jī)制也不清楚。本實(shí)驗(yàn)中,我們系統(tǒng)研究FSTL1預(yù)處理對心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷的保護(hù)作用,并進(jìn)一步對機(jī)制進(jìn)行了探討,研究自噬通路在這一過程中的作用。方法:第一部分首先研究體外缺血再灌注損傷模型中心肌細(xì)胞的自噬變化（p62、Beclin-1和LC3II/I蛋白表達(dá)變化）,再使用自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素和自噬抑制劑3-MA進(jìn)行自噬干預(yù),并檢測干預(yù)后心肌損傷情況（CCK-8檢測細(xì)胞活性、EDU檢測細(xì)胞增殖能力、流式Annexin V/PI檢測凋亡）,明確自噬在心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷中的作用;第二部分實(shí)驗(yàn)中采用FSTL1預(yù)處理心肌細(xì)胞,再行缺血再灌注處理,檢測心肌損傷標(biāo)志物CK-MB水平變化,同時(shí)CCK-8、EDU和AnnexinV/PI分別檢測FSTL1對缺血再灌注損傷心肌細(xì)胞活性、增殖和凋亡的影響;第三部分研究FSTL1預(yù)處理對于缺血再灌注損傷心肌細(xì)胞自噬（p62、Beclin-1、LC3 11/1蛋白表達(dá)以及mRFP-GFP-LC3檢測自噬流）的作用;并在FSTL1預(yù)處... 

【文章來源】：浙江大學(xué)浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：99 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

圖１－１?Ａ－Ｃ?Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ檢測大鼠心肌細(xì)胞Ｈ９Ｃ２在缺血缺氧再灌注前后，自噬??相關(guān)主要蛋白的變化

正文第一部分結(jié)果??Ｉ的相對表達(dá)量也明顯上調(diào)。說明缺血缺氧再灌注后，新生鼠未成熟原代心肌細(xì)胞??的自噬水平顯著提高。（圖１－２）??Ａ?Ｂ?Ｃ??＾?■?Ｃｏｎｔｒｏｌ?■?Ｃｏｎｔｒｏｌ??〇步?Ｏ?Ｈｙｐｏｘｉｃ－ｉｓｃｈｅｍｉｃ?Ｅ３?Ｈｙｐｏｘｉｃ－ｉｓｃｈｅｍｉｃ??１?２＇５ｉ?ｎ?．?３ｌ＾??＆?２．０－?ｒｉ?ｏ??ｐ６２?６２?ｋＤａ?｜?ｇ－?２－??＾?＊＊?圍?？孬［３??Ｂｅｃｌｉｎ－１?６〇?ｋＤａ?５?１分?＿?．?〇．?—??匕３?１二二誦３?ｊ?０５－?Ｉ?ｎ?Ｉ?§〇?＇?■??ＬＣ３?ＩＩ?１４?ｋＤａ?＾?〇?〇Ｊ．．．．．ＭＭ■■■＂．■—＿」■■■?｜?〇＿?Ｍ??Ｐａｃｔｉｎ?ｉ｜０ＭＰ?４３?ｋＤａ?＾?＾?？?々??°〇?＾??Ｉｍｍａｔｕｒｅ?ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ??圖１－２?Ａ－Ｃ?Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ檢測未成熟心肌細(xì)胞在缺血缺氧再灌注前后，自噬相關(guān)??主要蛋白的變化。Ｍ／＾Ｏ．Ｏｌｖｓｃｏｎｔｒｏｌ組??３．３雷帕霉素和３－ＭＡ干預(yù)在Ｈ９Ｃ２細(xì)胞ＩＲＩ中的作用??上述的實(shí)驗(yàn)證實(shí)：心肌細(xì)胞在ＩＲ１后自噬明顯增強(qiáng)，為進(jìn)一步明確自噬對于心??肌細(xì)胞的作用，我們使用自噬增強(qiáng)劑（雷帕霉素）和自噬抑制劑（３－ＭＡ）進(jìn)行干??預(yù)，分別使用１００ｎＭ雷帕霉素或５ｍＭ３－ＭＡ預(yù)處理６ｈ后，再進(jìn)行Ｉ／Ｒ處理。??３．３．１?ＣＣＫ８檢測Ｈ９Ｃ２細(xì)胞活性??用自噬抑制劑３－ＭＡ和自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素預(yù)處理Ｈ９Ｃ２細(xì)胞６ｈ后，再進(jìn)行??Ｉ／Ｒ處理，檢測處理前后細(xì)胞活性變化。利用ＣＣＫ－８檢測試劑盒來檢測細(xì)胞活性，??該試劑中含有ＷＳＴ－８

?正文第？部分結(jié)果??胞活性顯著升高。（圖１－３）??１２５－．??ｔ?１００－?—：￣｜?＃??咖ｈ??Ｃｏｎｔｒｏｌ?０?Ｒａｐａ?３－ＭＡ??Ｈｙｐｏｘｉｃ－ｉｓｃｈｅｍｉｃ?２４ｈ??圖１－３?ＣＣＫ－８檢測不同條件下細(xì)胞活性的變化。０組：未給予藥物干預(yù)的ＩＲＩ??組。＊Ｐ＜０．０５雷帕霉素ｖｓＯ組；＃尸＜０．０５?３－＾１八組ｖｓＯ組。??３．３．２?ＥＤＵ檢測Ｈ９Ｃ２細(xì)胞的增殖情況??同樣用自噬抑制劑３－ＭＡ和自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素預(yù)處理Ｈ９Ｃ２細(xì)胞６ｈ，再次??缺血缺氧再灌注后，細(xì)胞增殖變化。我們采用了?ＥＤＵ試劑盒來檢測細(xì)胞增殖能力，??因ＥｄＵ是一種胸腺嘧啶核苷類似物，在細(xì)胞增殖時(shí)期代替胸腺嘧啶核苷酸滲入正??在復(fù)制的ＤＮＡ分子，因此通過檢測ＥｄＵ標(biāo)記能準(zhǔn)確地反映細(xì)胞的增殖情況。結(jié)??果：與缺血缺氧再灌注組比較，自噬抑制劑組細(xì)胞增殖顯著降低；與缺血缺氧再??灌注組比較，自噬誘導(dǎo)劑組細(xì)胞增殖顯著升高。（圖］－４）??１９??


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