一、研究背景紫紺型先心病是復(fù)雜先心病的主要組成部分,心臟中存在右向左分流,慢性缺氧是其重要病理生理基礎(chǔ)。紫紺型先心病患者的血氧飽和度較低,但是他們能夠長(zhǎng)期耐受缺氧,直至手術(shù)治療,提示慢性缺氧可能促使心肌做出代償改變,而且這些改變能夠增強(qiáng)心肌細(xì)胞在缺氧條件下生存的能力。因此,尋找慢性缺氧條件下心肌細(xì)胞的代償機(jī)制可能有助于臨床上提高心肌保護(hù)策略,改善臨床治療效果。細(xì)胞自噬是通過吞噬胞質(zhì)蛋白或者細(xì)胞器,然后包被進(jìn)入囊泡,與溶酶體融合為自噬溶酶體,降解包被的內(nèi)容物的代謝過程。在無應(yīng)激條件下,基礎(chǔ)水平的自噬有助于細(xì)胞器更新和細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的維持。在缺氧等病理?xiàng)l件下,自噬通過降解細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和細(xì)胞器為細(xì)胞的生命活動(dòng)提供能量和營(yíng)養(yǎng)。腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)是高度保守的絲/蘇氨酸激酶,是細(xì)胞能量感受的關(guān)鍵分子。當(dāng)細(xì)胞中ATP水平減少時(shí),AMPK被活化,通過促進(jìn)代謝分解和抑制代謝合成,增加ATP供應(yīng)。此外,AMPK參與了自噬調(diào)控,能夠通過抑制mTORC1和激活ULK1增強(qiáng)自噬。雖然紫紺型先心病的具體發(fā)病機(jī)制尚不清楚,但是凋亡引起的心肌細(xì)胞減少被證明在紫紺型先心病的疾病進(jìn)程中具有重要意義。凋亡的調(diào)控是一個(gè)精密而復(fù)雜的過程,近期研究表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡在缺氧心肌細(xì)胞中發(fā)揮重要作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是蛋白折疊、鈣儲(chǔ)存和脂質(zhì)合成的核心細(xì)胞器。在缺氧等破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)的刺激下,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中錯(cuò)誤折疊蛋白不斷累積,導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。當(dāng)細(xì)胞處于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí),代償性的未折疊蛋白反應(yīng)被激活。未折疊蛋白反應(yīng)有助于恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài),包括三個(gè)分支:肌醇依賴性激酶1α(IRE1α,inositol-requiring protein-1α),活化轉(zhuǎn)錄因子6(ATF6,activating transcription factor6),和蛋白質(zhì)激酶R樣的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK,protein kinase RNA(PKR)-like ER kinase)。如果外源性刺激長(zhǎng)期得不到解決,未折疊蛋白反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致凋亡。目前,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)凋亡中的機(jī)制尚不清楚。IRE1α是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)中最為保守的感受分子。IRE1α可以激活凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1(ASK1)和p38 MAPK,促進(jìn)凋亡發(fā)生。研究表明細(xì)胞因子在人胰腺β細(xì)胞中作用于IRE1α,進(jìn)而激活JNK誘導(dǎo)凋亡發(fā)生。IRE1α信號(hào)通路在慢性缺氧心肌細(xì)胞中的作用研究尚未見報(bào)道。沉默信息調(diào)節(jié)因子1(Sirt1,silent mating type information regulator 2 homolog-1,Sirtuin 1)是輔酶I(NAD+)依賴的組蛋白去乙�；�,廣泛表達(dá)在真核細(xì)胞中。Sirt1通過去乙�；M蛋白和非組蛋白參與許多細(xì)胞活動(dòng),包括凋亡、自噬、能量限制、細(xì)胞分化、抗衰老以及DNA損傷修復(fù)。研究表明Sirt1在心肌缺血再灌注損傷、心肌肥厚、動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病中發(fā)揮保護(hù)作用。重要的是,研究發(fā)現(xiàn)Sirt1發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞缺氧有關(guān),能夠去乙酰化缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α和HIF-2α。這些結(jié)果提示Sirt1可能參與慢性缺氧心肌的適應(yīng)過程,但具體方式尚不清楚。基于以上文獻(xiàn)回顧,我們提出研究假設(shè):Sirt1可能通過調(diào)控自噬和凋亡參與了心肌細(xì)胞缺氧適應(yīng)的過程。二、研究目的本項(xiàng)目擬在臨床心肌標(biāo)本檢測(cè)慢性缺氧條件下凋亡和自噬相關(guān)蛋白以及Sirt1的表達(dá)變化;建立慢性缺氧細(xì)胞模型,應(yīng)用腺病毒Ad-Sirt1和Ad-Sh-Sirt1實(shí)現(xiàn)Sirt1的過表達(dá)和干擾。在細(xì)胞水平檢測(cè)Sirt1對(duì)缺氧心肌細(xì)胞自噬和凋亡的影響,以及AMPK和IRE1α信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的調(diào)控作用。建立慢性缺氧小鼠模型,運(yùn)用Sirt1激動(dòng)劑SRT1720和抑制劑EX-527檢測(cè)其對(duì)缺氧小鼠心肌自噬和凋亡的影響。三、研究方法1.人心肌標(biāo)本的收集:收集紫紺組和非紫紺組患者右室流出道組織:紫紺組為法洛四聯(lián)癥患者,非紫紺組為室間隔缺損合并右室流出道狹窄患者。提取組織蛋白,采用Western blot檢測(cè)自噬(LC3-II和p62),凋亡(cleaved Caspase 3和Bcl2)相關(guān)蛋白和Sirt1在兩組患者心肌標(biāo)本中的表達(dá)情況。2.探索Sirt1在缺氧H9C2細(xì)胞自噬中的作用及調(diào)控機(jī)制:2.1建立慢性缺氧細(xì)胞模型:將無血清培養(yǎng)基饑餓過夜的H9C2心肌細(xì)胞置于O_2 1%,CO_2 5%,N_2 94%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,建立慢性缺氧細(xì)胞模型;常氧組氧濃度為21%。2.2檢測(cè)Ad-Sirt1過表達(dá)和Ad-Sh-Sirt1干擾的效果,Ad-LacZ作為對(duì)照,并檢測(cè)Sirt1對(duì)基礎(chǔ)自噬的影響。2.3將細(xì)胞分為常氧+Ad-LacZ組,缺氧+Ad-LacZ組,常氧+Ad-Sh-Sirt1組,缺氧+Ad-Sh-Sirt1組,檢測(cè)LC3-II和p62的表達(dá)變化。2.4將細(xì)胞分為常氧+Ad-LacZ組,缺氧+Ad-LacZ組,缺氧+Ad-Sirt1組,缺氧+Ad-Sh-Sirt1組,檢測(cè)各組心肌細(xì)胞p-AMPK和AMPK蛋白表達(dá)情況。2.5將細(xì)胞分為常氧+Ad-LacZ組,缺氧+Ad-LacZ組,缺氧+Ad-Sirt1組,缺氧+Ad-Sirt1+Compound C組,檢測(cè)各組心肌細(xì)胞LC3-II和p62蛋白表達(dá)情況。3.研究Sirt1在慢性缺氧心肌細(xì)胞凋亡中的作用3.1將細(xì)胞分為常氧+Ad-LacZ組,缺氧+Ad-LacZ組,缺氧+Ad-Sirt1組,缺氧+Ad-Sh-Sirt1組。Western blot檢測(cè)各組心肌細(xì)胞cleaved Caspase 3和Bcl2蛋白表達(dá)情況;流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡的變化情況。Western blot檢測(cè)過表達(dá)和干擾Sirt1后,IRE1α和p-IRE1α蛋白的表達(dá)水平的變化。3.2運(yùn)用慢病毒Lv-Sh-IRE1α干擾IRE1α表達(dá),Ad-IRE1α過表達(dá)IRE1α,Western blot驗(yàn)證效率。將細(xì)胞分為L(zhǎng)v-Sh-Scramble+常氧組,Lv-Sh-Scramble+缺氧組,Lv-Sh-IRE1α+常氧組,Lv-Sh-IRE1α+缺氧組,Ad-LacZ+常氧組,Ad-LacZ+缺氧組,Ad-IRE1α+常氧組,Ad-IRE1α+缺氧組,共計(jì)8組。Western blot檢測(cè)各組凋亡相關(guān)蛋白cleaved Caspase 3和Bcl2蛋白的表達(dá)情況。Western blot檢測(cè)各組JNK、c-jun、NF-κB p65的表達(dá)及磷酸化。3.3將細(xì)胞分為Ad-LacZ+缺氧組,Ad-IRE1α+缺氧組,Ad-Sirt1+缺氧組,Ad-IRE1α+Sirt1+缺氧組,Western blot檢測(cè)各組心肌細(xì)胞cleaved Caspase 3和Bcl2蛋白表達(dá)情況。Western blot檢測(cè)各組JNK、c-jun、NF-κB p65的表達(dá)及磷酸化。4.研究Sirt1激動(dòng)劑和抑制劑在慢性缺氧小鼠心肌細(xì)胞自噬和凋亡中的影響。4.1將8-10周齡的雄性C57BL/6J小鼠分為常氧+DMSO組,缺氧+DMSO組,缺氧+SRT1720組,缺氧+EX-527組(每組10只)。缺氧組小鼠飼養(yǎng)于Ruskinn低氧工作站,氧濃度為10%。常氧組氧濃度為21%。SRT1720為Sirt1激動(dòng)劑,劑量為50 mg/kg/d,EX-527為Sirt1的抑制劑,劑量為10 mg/kg/d,給藥方式為腹腔注射。缺氧飼養(yǎng)時(shí)間為2周。4.2待缺氧時(shí)間結(jié)束后,檢查小鼠血紅蛋白濃度和紅細(xì)胞比容評(píng)估缺氧效果,同時(shí)收集小鼠心臟。免疫熒光檢查常氧組和缺氧組HIF-1α表達(dá)情況。4.3 Western blot檢測(cè)各組小鼠心肌組織中Sirt1、Acet-p53、p53蛋白的表達(dá)情況。4.4 Western blot檢測(cè)各組小鼠心肌組織中LC3-II、p62、p-AMPK、AMPK蛋白的表達(dá)情況。免疫熒光檢測(cè)各組LC3-B的表達(dá)變化。4.5 Western blot檢測(cè)各組小鼠心肌cleaved Caspase 3、Bcl2、p-IRE1α、IRE1α蛋白的表達(dá)情況。TUNEL法檢測(cè)各組小鼠心肌凋亡比例的變化。四、研究結(jié)果1.Western blot結(jié)果顯示紫紺組患者心肌中Sirt1的表達(dá)顯著高于非紫紺組。同非紫紺組相比,紫紺組中LC3-II表達(dá)明顯增加而p62表達(dá)明顯降低,此外紫紺組中cleaved Caspase3表達(dá)明顯增加而Bcl2表達(dá)明顯降低。2.同對(duì)應(yīng)的Ad-LacZ組相比,Ad-Sirt1組中明顯Sirt1的表達(dá)量明顯上調(diào),而Ad-Sh-Sirt1組則顯著降低。Western blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白表達(dá),結(jié)果表明在Ad-Sirt1組中LC3II的表達(dá)上調(diào),而p62的表達(dá)明顯下調(diào)。同缺氧對(duì)照組相比,Ad-Sh-Sirt1+缺氧組中LC3-II的表達(dá)降低,p62的表達(dá)增加。同缺氧對(duì)照組相比,Ad-Sirt1+缺氧組p-AMPK/AMPK比值增加,Ad-Sh-Sirt1+缺氧組p-AMPK/AMPK比值降低。同缺氧對(duì)照組相比,Ad-Sirt1+缺氧組中LC3-II的表達(dá)增加,p62的表達(dá)減少,當(dāng)AMPK抑制劑Compound C加入后Sirt1的促自噬作用被抑制。3.利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)缺氧心肌凋亡,結(jié)果顯示同缺氧對(duì)照組相比,Ad-Sirt1組的凋亡細(xì)胞所占比值明顯減少,而在Ad-Sh-Sirt1組中顯著增加。Western blot法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白,結(jié)果表明Ad-Sirt1組中cleaved Caspase 3表達(dá)顯著下調(diào),Bcl2表達(dá)顯著上調(diào),而在Ad-Sh-Sirt1組中結(jié)果相反。同對(duì)應(yīng)的缺氧對(duì)照組相比,Ad-Sirt1+缺氧組p-IRE1α/IRE1α比值明顯降低,Ad-Sh-Sirt1+缺氧組p-IRE1α/IRE1α比值明顯增加。同缺氧對(duì)照組相比,IRE1α過表達(dá)組中cleaved Caspase 3表達(dá)增加,Bcl2的表達(dá)降低,而在IRE1α干擾組中cleaved Caspase3表達(dá)減少,Bcl2的表達(dá)增加。進(jìn)一步的結(jié)果表明同對(duì)應(yīng)的缺氧對(duì)照組相比,IRE1α過表達(dá)組中p-JNK/JNK、p-cjun/cjun和p-p65/p65 NF-κB的比值明顯增加,而在IRE1α干擾組中p-JNK/JNK、p-cjun/cjun和p-p65/p65 NF-κB的比值明顯減少。Western blot結(jié)果表明,同Ad-LacZ+缺氧組相比,Ad-IRE1α+缺氧組中p-JNK/JNK、p-cjun/cjun和p-p65/p65 NF-κB的比值明顯增加,而共同過表達(dá)Sirt1后上述比值降低。4.和常氧組小鼠相比,缺氧組小鼠中血紅蛋白和紅細(xì)胞比容明顯增加,HIF-1α免疫熒光強(qiáng)度明顯增加。同缺氧組小鼠相比,干擾組(EX-527)中Sirt1蛋白的表達(dá)明顯降低,acetyl-p53/p53的比值明顯增加,而激動(dòng)組(SRT1720)中Sirt1蛋白的表達(dá)明顯增加,acetyl-p53/p53的比值明顯降低。同缺氧組小鼠相比,干擾組中p-AMPK/AMPK的比值和LC3-II表達(dá)明顯降低,p62表達(dá)水平明顯增加,而在激動(dòng)組中p-AMPK/AMPK的比值和LC3-II表達(dá)明顯增高,而p62表達(dá)水平明顯降低。LC3-B免疫熒光染色的結(jié)果表明同缺氧組相比,EX-527組中LC3-B免疫熒光強(qiáng)度明顯降低,SRT1720組中LC3-B的免疫熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。Western blot結(jié)果表明同缺氧組小鼠相比,EX-527組中p-IRE1α/IRE1α的比值和cleaved Caspase 3表達(dá)增加,Bcl2表達(dá)降低;而SRT1720組中p-IRE1α/IRE1α的比值和cleaved Caspase 3表達(dá)減少,Bcl2表達(dá)增加。TUNEL熒光染色結(jié)果表明同缺氧組小鼠相比,干擾組中凋亡細(xì)胞所占的比值明顯增加,而激動(dòng)組中凋亡細(xì)胞所占的比值明顯減少。五、研究結(jié)論1.紫紺組患者心肌中Sirt1表達(dá)水平高于非紫紺組。紫紺組患者心肌中自噬和凋亡水平高于非紫紺組。2.在H9C2心肌細(xì)胞系中,上調(diào)Sirt1可顯著增強(qiáng)缺氧心肌細(xì)胞自噬,Sirt1的促自噬作用與AMPK激活有關(guān)。3.在H9C2心肌細(xì)胞系中,上調(diào)Sirt1可顯著減少缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。IRE1α為Sirt1調(diào)控的靶蛋白,上調(diào)Sirt1表達(dá)后,缺氧心肌細(xì)胞中IRE1α/JNK/c-jun和NF-κB p65通路的激活受到抑制。4.在缺氧小鼠心肌中,藥物激活Sirt1(SRT1720)能夠增強(qiáng)自噬和緩解凋亡,而干擾Sirt1(EX-527)則會(huì)抑制自噬和加劇凋亡。
【學(xué)位單位】：中國(guó)人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R541.1
【部分圖文】：

陸軍軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文果irt1 表達(dá)和凋亡在紫紺型先心病患者的心肌組織中增加測(cè)了紫紺組和非紫紺組患者心肌組織中Sirt1的表達(dá)。如圖1-1和組中的表達(dá)明顯高于非紫紺組（p<0.05），說明 Sirt1 在慢性缺氧我們運(yùn)用 Western blot 檢測(cè)了凋亡相關(guān)蛋白，包括促凋亡的 clea Bcl2 表達(dá)情況。cleaved Caspase 3 在紫紺組中高于非紫紺組（p低于非紫紺組（p<0.05）。上述結(jié)果表明，凋亡在紫紺組心肌細(xì)胞

estern blot 顯示 LC3-II 和 p62 蛋白在紫紺組和非紫紺組先心病患者心肌組織圖 1-3 圖 1-1 和圖 1-2 的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，n=10，*表示同非紫紺組相比 p<0.05。

31stern blot 檢測(cè)各組中 Sirt1，LC3-II，p62 的表達(dá)水平。*表示同 Ad-LacZ 組相 干擾 Sirt1 對(duì)缺氧心肌細(xì)胞自噬的影響究 Sirt1 在缺氧誘導(dǎo)自噬中的作用，我們觀察了 Sirt1 被干擾后在缺。如圖 2-2 所示，同 Ad-LacZ+缺氧對(duì)照組相比，Ad-Sh-Sirt1+缺氧降低（p<0.05），而 p62 的表達(dá)明顯增加（p<0.05）。表明，缺氧條自噬水平受到抑制。
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本文編號(hào)：2879613