發(fā)布時間：2020-11-11 17:31

　　 第一部分抑制法尼基焦磷酸鹽合成酶可以改善培養(yǎng)的大鼠心臟源性H9c2細(xì)胞的缺氧/復(fù)氧損傷研究背景:心肌梗死(MI)能夠通過持續(xù)的缺血在病理上引起心肌細(xì)胞死亡,是冠心病(CHD)的最嚴(yán)重的表現(xiàn)形式。及時恢復(fù)冠脈血供是其重要的治療手段。然而,研究表明恢復(fù)血供的過程中會進(jìn)一步加重心臟的損傷,即缺血再灌注(IR)損傷,占心肌梗死引起的死亡率的四分之一。法尼基焦磷酸鹽合成酶(FPPS)是甲羥戊酸途徑中的一種關(guān)鍵酶。它在類異戊二烯的生物合成中具有非常重要的作用,可以催化異戊烯焦磷酸鹽和牻牛兒基焦磷酸鹽合成法尼基焦磷酸鹽(FPP)和牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸鹽(GGPP)。FPP和GGPP在小G蛋白的活化中具有非常重要的作用。已有研究表明FPPS在小鼠心肌肥厚、'纖維化和心室重塑的過程中起著非常重要的作用。但其對心肌缺血再灌注損傷的作用尚不清楚。另有研究表明小G蛋白Racl在心肌缺血再灌注損傷中具有非常重要的作用。目的:本實驗使用大鼠心臟來源的H9c2細(xì)胞,對其進(jìn)行缺氧/復(fù)氧處理,體外模擬心肌缺血再灌注的過程。探索FPPS表達(dá)量改變對心肌缺血再灌注損傷的影響及相應(yīng)的機制。方法:(1)體外培養(yǎng)H9c2細(xì)胞,用FPPS過表達(dá)質(zhì)粒及其RNA干擾質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的細(xì)胞。用real-time PCR及western blot鑒定轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞FPPS的表達(dá)水平。(2)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞給予缺氧8小時后復(fù)氧4小時的處理。(3)用CCK法測定缺氧/復(fù)氧后細(xì)胞的存活率。(4)用乳酸脫氫酶(LDH)和超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒分別測定培養(yǎng)基中LDH的釋放量和細(xì)胞裂解產(chǎn)物中SOD的水平。(5)用流式細(xì)胞儀測定缺氧/復(fù)氧后不同組細(xì)胞的凋亡率。(6)用G-Lisa法測定小G蛋白Racl的活性。(7)用ROS試劑盒檢測缺氧/復(fù)氧后細(xì)胞中ROS的水平。結(jié)果:(l)FPPS過表達(dá)質(zhì)粒使細(xì)胞FPPS表達(dá)水平明顯增加,RNA干擾的質(zhì)粒使細(xì)胞FPPS的表達(dá)水平顯著降低。(2)FPPS過表達(dá)使細(xì)胞缺氧/復(fù)氧后存活率明顯降低,抑制FPPS表達(dá)使缺氧/復(fù)氧后細(xì)胞的存活率增加。(3)FPPS過表達(dá)使缺氧/復(fù)氧后培養(yǎng)基中LDH釋放量明顯升高,細(xì)胞裂解產(chǎn)物中SOD的量顯著降低,而抑制FPPS表達(dá)與其有相反的作用。(4)FPPS過表達(dá)使缺氧/復(fù)氧后細(xì)胞的凋亡率顯著增加,抑制FPPS表達(dá)使缺氧/復(fù)氧后細(xì)胞的凋亡率顯著下降。(5)FPPS過表達(dá)可使缺氧/復(fù)氧細(xì)胞的小G蛋白Racl的活性明顯增加,抑制FPPS的表達(dá)可明顯降低缺氧/復(fù)氧細(xì)胞的小G蛋白Racl的活性。(6)FPPS過表達(dá)使缺氧/復(fù)氧后細(xì)胞ROS的產(chǎn)生量明顯增加,抑制FPPS的表達(dá)使缺氧/復(fù)氧后細(xì)胞的ROS產(chǎn)生量顯著降低。結(jié)論:FPPS過表達(dá)可加重H9c2細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷,抑制FPPS表達(dá)可改善其損傷程度,該現(xiàn)象可能與小G蛋白Racl的活性改變,進(jìn)而引起ROS產(chǎn)生量的改變有關(guān)。第二部分法尼基焦磷酸鹽合成酶過表達(dá)加重小鼠心肌缺血再灌注損傷研究背景:缺血性心臟病是全球性致死和致殘的一個重要原因,及時恢復(fù)冠脈血供是其重要的治療手段。然而,研究表明恢復(fù)血供的過程中會進(jìn)一步加重心臟的損傷,即缺血再灌注(IR)損傷,占心肌梗死引起的死亡率的四分之一。法尼基焦磷酸鹽合成酶(FPPS)是甲羥戊酸途徑中的一種關(guān)鍵酶。它在類異戊二烯的生物合成中具有非常重要的作用,可以催化異戊烯焦磷酸鹽和牻牛兒基焦磷酸鹽合成法尼基焦磷酸鹽(FPP)和牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸鹽(GGPP)。FPP和GGPP在小G蛋白的活化中具有非常重要的作用。本研究第一部分已證實FPPS過表達(dá)加重缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的培養(yǎng)的大鼠心臟源性的H9c2細(xì)胞的損傷,抑制FPPS表達(dá)對缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的H9c2的損傷有保護(hù)作用。該現(xiàn)象與小G蛋白Racl的活性增加從而增加ROS的產(chǎn)生有關(guān)。另有研究表明小G蛋白Racl在心肌缺血再灌注損傷中具有非常重要的作用。而GGPP為Racl的激活提供類異戊烯化基團(tuán)。目的:本研究利用轉(zhuǎn)基因小鼠模型研究和探討FPPS過表達(dá)對心肌缺血再灌注損傷的影響及其相應(yīng)的作用機制。方法:(1)FPPS轉(zhuǎn)基因小鼠來自本課題組。用real-time PCR、western-blot等方法檢測轉(zhuǎn)基因小鼠心臟組織中FPPS mRNA及蛋白的表達(dá)水平。(2)使用Langendorff裝置構(gòu)建FPPS轉(zhuǎn)基因小鼠及野生小鼠的缺血再灌注損傷模型,并使用生物信號采集系統(tǒng)記錄缺血再灌注過程中心功能、心率的變化。(3)使用肌酸激酶(CK)和乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒測定灌流液中CK和LDH的水平。(4)使用氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法測定心肌梗死面積。(5)使用G-Lisa方法測定心臟組織中小G蛋白Racl的表達(dá)水平。(6)使用活性氧(ROS)試劑盒測定心臟組織中ROS的量。結(jié)果:(1)FPPS轉(zhuǎn)基因小鼠心臟組織中FPPSmRNA及蛋白的表達(dá)量明顯升高。(2)心臟特異性的FPPS過表達(dá)降低了缺血再灌注損傷后心功能的恢復(fù)水平,而對心率無明顯影響。(3)心臟特異性的FPPS過表達(dá)使缺血再灌注過程中灌流液中CK和LDH釋放量增加。(4)心臟特異性的FPPS過表達(dá)使缺血再灌注損傷后心肌梗死面積明顯增加。(5)心臟特異性的FPPS過表達(dá)使缺血再灌注過程中小G蛋白Racl的活性增加。(6)心臟特異性的FPPS過表達(dá)增加了缺血再灌注過程中ROS的產(chǎn)生量。結(jié)論:FPPS過表達(dá)可以加重小鼠心肌缺血再灌注損傷,其機制可能與小G蛋白Racl活性增加,進(jìn)而增加ROS的產(chǎn)生,加重心肌細(xì)胞的壞死和凋亡有關(guān)。第三部分牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸鹽合成酶對培養(yǎng)的大鼠心臟源性H9c2細(xì)胞的缺氧/復(fù)氧損傷的影響研究背景:心臟缺血性疾病在恢復(fù)血供的過程中會進(jìn)一步加重心臟的損傷,即缺血再灌注(IR)損傷,包括可逆性損傷和不可逆性損傷兩種。IR引起的死亡率占心肌梗死引起的死亡率的四分之一。牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸鹽合成酶(GGPPS)可以催化合成GGPP,而GGPP在小G蛋白異戊烯化的過程中起著非常重要的作用。本研究的第一部分和第二部分證實FPPS表達(dá)量的改變可以引起小G蛋白Racl活性的改變,而后者可以改變ROS的產(chǎn)生,從而影響心肌缺血再灌注損傷的程度。本研究通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的方法改變H9c2細(xì)胞GGPPS的表達(dá)量,研究GGPPS在鼠心臟源性的H9c2細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷中的作用。目的本實驗使用鼠心臟來源的H9c2細(xì)胞,體外模擬心肌缺血再灌注的過程。探索GGPPS表達(dá)量改變對心肌缺血再灌注損傷的影響,及相應(yīng)的機制。方法:(1)構(gòu)建GGPPS過表達(dá)及其RNA干擾質(zhì)粒。(2)體外培養(yǎng)H9c2細(xì)胞,用GGPPS過表達(dá)質(zhì)粒及其RNA干擾質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的細(xì)胞。用real-time PCR及western blot鑒定轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞GGPPS mRNA及蛋白的表達(dá)水平。(3)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞給予缺氧8小時后復(fù)氧4小時的處理。(4)用CCK法測定缺氧/復(fù)氧后細(xì)胞的存活率。(5)用乳酸脫氫酶(LDH)和超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒分別測定培養(yǎng)基中LDH的釋放量和細(xì)胞裂解產(chǎn)物中SOD的水平。(6)用流式細(xì)胞儀測定缺氧/復(fù)氧后不同組細(xì)胞的凋亡率。(7)用G-Lisa法測定小G蛋白Racl的活性。(8)用ROS試劑盒檢測缺氧/復(fù)氧后細(xì)胞中ROS的水平。結(jié)果:(1)GGPPS過表達(dá)質(zhì)粒使細(xì)胞GGPPS mRNA及蛋白的表達(dá)水平明顯增加,RNA干擾的質(zhì)粒使其表達(dá)水平顯著降低。(2)GGPPS過表達(dá)使細(xì)胞缺氧/復(fù)氧后存活率明顯降低,抑制GGPPS表達(dá)使缺氧/復(fù)氧后細(xì)胞的存活率增加。(3)GGPPS過表達(dá)使缺氧/復(fù)氧后培養(yǎng)基中LDH釋放量明顯升高,細(xì)胞裂解產(chǎn)物中SOD的量顯著降低,而抑制GGPPS表達(dá)與其有相反的作用。(4)GGPPS過表達(dá)使缺氧/復(fù)氧后細(xì)胞的凋亡率顯著增加,抑制GGPPS表達(dá)使缺氧/復(fù)氧后細(xì)胞的凋亡率顯著下降。(5)GGPPS過表達(dá)可使缺氧/復(fù)氧細(xì)胞的小G蛋白Racl的活性明顯增加,抑制GGPPS的表達(dá)可使缺氧/復(fù)氧細(xì)胞的小G蛋白Racl的活性明顯下降。(6)GGPPS過表達(dá)使缺氧/復(fù)氧后細(xì)胞ROS的產(chǎn)生量明顯增加,抑制GGPPS的表達(dá)使缺氧/復(fù)氧后細(xì)胞的ROS產(chǎn)生量顯著降低。結(jié)論:GGPPS過表達(dá)可加重H9c2細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷,抑制GGPPS的表達(dá)可減輕其損傷,該現(xiàn)象的可能與小G蛋白Racl的活性改變,進(jìn)而引起ROS產(chǎn)生量的改變有關(guān)。
【學(xué)位單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R542.22
【部分圖文】：

圖１．３．１質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后Ｈ９ｃ２細(xì)胞中ＦＰＰＳ的表達(dá)水平。（Ａ）質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Ｈ９ｃ２細(xì)??胞的效果。轉(zhuǎn)染效果用焚光顯微鏡下ＧＦＰ陽性細(xì)胞占總細(xì)胞的百分比表示。（Ｂ）??流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。（Ｃ）轉(zhuǎn)染后４８?ｈＦＰＰＳ蛋白表達(dá)水平。內(nèi)參為Ｔｕｂｕｌｉｎ。??（Ｄ）Ｗｅｓｔｅｒｎ?Ｂｌｏｔ結(jié)果半定量分析。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（ｍｅａｎ?±?ＳＥＭ）表示（ｎ＝３?）。??＊＊Ｐ＜?０．０１?ｖｓｐＥ－ＧＦＰ，＊＊＊Ｐ＜?０．００１?ｖｓ?ｐＥ－ＧＦＰ“Ｅ）ＲＴ－ＰＣＲ?結(jié)果?ｃ?內(nèi)參為?ＧＡＰＤＨ。??結(jié)果以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)誤表示（ｍｅａｎ?士?ＳＥＭ）?（ｎ＝３?）。料叩＜?０．００１?ｖｓ?ｐＥ－ＧＦＰ。??２１??

圖１．３．２基因擴增曲線圖和溶解曲線圖示例（儀器：ＡＢＩ７５００）??３．２?ＦＰＰＳ表達(dá)量的改變對缺氧／復(fù)氧后Ｈ９ｃ２細(xì)胞增殖的影響??３．２．１?ＦＰＰＳ表達(dá)量的改變對缺氧／復(fù)氧后Ｈ９ｃ２細(xì)胞存活率的影響??用質(zhì)粒ｐＥ－ｍＦＰＰＳ、ｓｈＦＰＰＳ及對照質(zhì)粒ｐＥ－ＧＦＰ轉(zhuǎn)染Ｈ９ｃ２細(xì)胞，４８小時后??對細(xì)胞進(jìn)行缺氧８小時，隨后復(fù)氧４小時的處理。用ＣＣＫ試劑盒檢測細(xì)胞的存活??率。結(jié)果如圖１．３．３所示：與對照組相比，ＦＰＰＳ過表達(dá)細(xì)胞缺氧／復(fù)氧后（ｐＥ－ｍＦＰＰＳ??＋?ＨＲ組）存活率顯著降低，ＦＰＰＳ干擾細(xì)胞缺氧／復(fù)氧后（ｓｈＦＰＰＳ?＋?ＨＲ組）存活??率明顯升高。??２２??

圖１．３．３Ｈ９ｃ２細(xì)胞缺氧／復(fù)氧后的存活率。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（ｍｅａｎ±ＳＥ表示（ｎ＝６）。繼Ｐ?＜?０．００１?ｖｓ?ＣＯＮ，＊Ｐ?＜?０．０５?ｖｓ?ｐＥ－ＧＦＰ?＋?ＨＲ，?＊叩?＜?０．０１?ｖｓ?ｐＥ－＋?ＨＲＸＯＮ：空白對照組；ｐＥ－ＧＦＰ：空質(zhì)粒對照組；ｓｈＦＰＰＳ：?ＦＰＰＳ干擾組；ｐＥ－ｍＦＦＰＰＳ過表達(dá)組；ＨＲ：缺氧／復(fù)氧。??３．２．２?ＦＰＰＳ表達(dá)量改變對缺氧／復(fù)氧后Ｈ９ｃ２細(xì)胞凋亡的影響??用質(zhì)粒ｐＥ－ｍＦＰＰＳ、ｓｈＦＰＰＳ及對照質(zhì)粒ｐＥ－ＧＦＰ轉(zhuǎn)染Ｈ９ｃ２細(xì)胞，４８小對細(xì)胞進(jìn)行缺氧８小時，隨后復(fù)氧４小時的處理。用流式細(xì)胞以檢測各組細(xì)調(diào)亡率。結(jié)果如圖１．３．４所不：缺氧／復(fù)氧后，Ｈ９ｃ２細(xì)胞的調(diào)亡（早期調(diào)亡和凋亡）率分別為：ｐＥ－ＧＦＰ?＋?ＨＲ?組（７．８６３?±?０．４３８％），?ｐＥ－ｍＦＰＰＳ?＋?ＨＲ?組（１５．９０．３５６％），?ｓｈＦＰＰＳ?＋?ＨＲ組（５．６００±０．１９１％）。由此看出ＦＰＰＳ過表達(dá)加重缺氧／后Ｈ９ｃ２細(xì)胞的凋亡率，干擾ＦＰＰＳ基因表達(dá)可降低其凋亡率。??
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本文編號：2879510