第一部分Micro-CT主動(dòng)脈增強(qiáng)造影在主動(dòng)脈夾層模型小鼠活體觀察中的應(yīng)用研究背景主動(dòng)脈夾層小鼠模型是目前較常用的主動(dòng)脈夾層動(dòng)物模型,由于缺乏相應(yīng)的影像技術(shù),目前判斷主動(dòng)脈病變情況的方法主要依靠主動(dòng)脈病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果,該過程須處死造模動(dòng)物,因此無法動(dòng)態(tài)觀測(cè)夾層形成過程和病情進(jìn)展情況,給研究造成了一定的局限性,因此亟需一種可以活體觀察主動(dòng)脈病變情況的成像方法。研究目的本研究擬通過聯(lián)合應(yīng)用micro-CT和對(duì)比劑獲得針對(duì)小鼠主動(dòng)脈夾層的最佳成像方案,實(shí)現(xiàn)對(duì)夾層模型小鼠主動(dòng)脈病變區(qū)的活體觀察,以應(yīng)用于以主動(dòng)脈夾層為代表的主動(dòng)脈擴(kuò)張性疾病的基礎(chǔ)研究。探討對(duì)比劑種類、掃描時(shí)間、對(duì)比劑劑量對(duì)小鼠主動(dòng)脈增強(qiáng)造影成像效果的影響,初步總結(jié)小鼠主動(dòng)脈增強(qiáng)造影的最佳方案;建立主動(dòng)脈夾層小鼠模型,驗(yàn)證掃描方案的可行性和有效性。研究方法選取ExiTron nano 12000和eXIA 160XL兩種常用小動(dòng)物對(duì)比劑,將6只C57BL/6野生型正常小鼠隨機(jī)分為2組,Ⅰ組(ExiTron nano 12000組)、Ⅱ組(eXIA160XL組),通過鼠尾靜脈將兩種小動(dòng)物對(duì)比劑分別注射到小鼠體內(nèi),通過micro-CT掃描觀察兩種對(duì)比劑的造影效果并選出主動(dòng)脈成像效果最佳的對(duì)比劑;將3只C57BL/6野生型正常小鼠在注射基于上述實(shí)驗(yàn)得出的最佳對(duì)比劑后即刻、1h、2h、3h、6h和12h進(jìn)行micro-CT掃描,通過觀察掃描圖像得出最佳的掃描時(shí)間;應(yīng)用上述實(shí)驗(yàn)得出的最佳對(duì)比劑和最佳掃描時(shí)間,將21只主動(dòng)脈夾層小鼠隨機(jī)分為3組,3組分別注射不同劑量的對(duì)比劑,Ⅰ組(70μl/25g組)、Ⅱ組(100μl/25g組)、Ⅲ組(150μl/25g組),通過比較得出主動(dòng)脈成像效果最佳的對(duì)比劑劑量。解剖小鼠,采集主動(dòng)脈標(biāo)本,通過蘇木素-伊紅(HE)染色,借助NDP.view 2軟件測(cè)量小鼠主動(dòng)脈直徑,并與micro-CT測(cè)量所得的直徑進(jìn)行比較,驗(yàn)證掃描方案的可行性和有效性。結(jié)果主動(dòng)脈增強(qiáng)造影結(jié)果顯示,ExiTron nano 12000對(duì)比劑CT峰值為610HU,在體內(nèi)停留時(shí)間約12小時(shí);eXIA 160XL對(duì)比劑CT峰值為235HU,在體內(nèi)停留時(shí)間約6小時(shí)。ExiTron nano 12000對(duì)比劑成像效果優(yōu)于eXIA 160XL對(duì)比劑。在ExiTron nano 12000對(duì)比劑注射后即刻、1h、2h、3h、6h和12h進(jìn)行Micro-CT掃描,結(jié)果顯示小鼠在注射對(duì)比劑后2h,主動(dòng)脈CT值達(dá)到最高,主動(dòng)脈的成像效果最佳;通過比較注射不同劑量ExiTron nano 12000對(duì)比劑的夾層小鼠主動(dòng)脈成像效果,結(jié)果顯示對(duì)比劑劑量達(dá)到100μl/25g時(shí),可清晰顯示主動(dòng)脈結(jié)構(gòu),觀察到主動(dòng)脈夾層真假腔;將micro-CT掃描得到的主動(dòng)脈直徑值與樣本組織HE染色得到的主動(dòng)脈直徑值進(jìn)行比較,兩者基本一致(R~2=0.96)。結(jié)論Micro-CT和ExiTron nano 12000對(duì)比劑的聯(lián)合應(yīng)用可活體動(dòng)態(tài)觀察小鼠主動(dòng)脈形態(tài);對(duì)比劑ExiTron nano 12000注射后2小時(shí)為最佳的掃描時(shí)間;最佳對(duì)比劑劑量為100μl/25g。該掃描方案可用于小鼠主動(dòng)脈的增強(qiáng)造影成像,也可用于夾層小鼠主動(dòng)脈的活體動(dòng)態(tài)觀察,適用于主動(dòng)脈疾病的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究。第二部分N-乙�；�-L-半胱氨酸在主動(dòng)脈夾層血管重構(gòu)中的作用及機(jī)制研究研究背景主動(dòng)脈夾層(Aortic dissection,AD)是一類十分兇險(xiǎn)的致死性主動(dòng)脈疾病,隨著我國(guó)人口結(jié)構(gòu)的逐漸老齡化,以主動(dòng)脈夾層為代表的主動(dòng)脈擴(kuò)張病發(fā)病率逐年上升。我們前期研究發(fā)現(xiàn),主動(dòng)脈夾層患者血清中L-半胱氨酸水平明顯低于健康志愿者,且在構(gòu)建小鼠主動(dòng)脈夾層模型過程中添加L-半胱氨酸飲食可明顯減低夾層發(fā)生率,說明L-半胱氨酸可影響主動(dòng)脈夾層的發(fā)生。N-乙�；�-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)為L(zhǎng)-半胱氨酸的水溶性前體,在體內(nèi)可直接轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-半胱氨酸,已有研究表明NAC可調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝活性、減輕DNA損傷,具有一定的抗氧化和抗炎作用。因此本研究擬觀察NAC能否影響造模成功后夾層小鼠模型主動(dòng)脈血管重構(gòu),從而影響主動(dòng)脈夾層的轉(zhuǎn)歸,為主動(dòng)脈夾層的干預(yù)策略提供新靶點(diǎn)和新思路。研究目的主動(dòng)脈夾層小鼠模型構(gòu)建成功后,在小鼠飲食中添加NAC,干預(yù)主動(dòng)脈夾層小鼠體內(nèi)L-半胱氨酸含量,觀察NAC是否可以逆轉(zhuǎn)主動(dòng)脈病變的擴(kuò)張程度或嚴(yán)重程度,最終能否參與主動(dòng)脈血管重構(gòu)從而影響夾層轉(zhuǎn)歸。研究方法隨機(jī)選取3周齡C57BL/6野生型小鼠,采用飲水中添加β-氨基丙腈(1g/kg/d)喂養(yǎng)4周,然后在小鼠背部皮下植入血管緊張素Ⅱ微泵(1μg/kg/min)3天的方法,建立小鼠主動(dòng)脈夾層模型。同時(shí),使用3周齡C57BL/6野生型小鼠,正常飲水,4周后,麻醉下小鼠背部皮下植入生理鹽水微泵3天(假手術(shù)組)。將49只主動(dòng)脈夾層模型小鼠隨機(jī)分為2組,分別用NAC(主動(dòng)脈夾層模型+NAC組,Model+NAC Group)和生理鹽水(主動(dòng)脈夾層模型+生理鹽水組,Model Control Group)進(jìn)行干預(yù)。研究過程中如果小鼠發(fā)生死亡,立即記錄小鼠死亡時(shí)間,干預(yù)28天后,根據(jù)記錄結(jié)果繪制生存曲線;主動(dòng)脈夾層模型小鼠干預(yù)28天后,利用小動(dòng)物超聲檢測(cè)小鼠射血分?jǐn)?shù)(EF)和縮短分?jǐn)?shù)(FS),排除NAC對(duì)小鼠的心功能;分別在NAC干預(yù)后的第1天、第14天、第28天,使用micro-CT動(dòng)態(tài)觀察干預(yù)過程中小鼠主動(dòng)脈病變情況的變化;干預(yù)28天后,處死小鼠,解剖分離小鼠主動(dòng)脈,取主動(dòng)脈根部至髂總動(dòng)脈段進(jìn)行HE染色,參考主動(dòng)脈病變嚴(yán)重程度的評(píng)估標(biāo)準(zhǔn),對(duì)每個(gè)組織樣本主動(dòng)脈病變的嚴(yán)重程度進(jìn)行評(píng)估;測(cè)量主動(dòng)脈各段(升主動(dòng)脈、主動(dòng)脈弓、胸降主動(dòng)脈、腎上主動(dòng)脈)管腔直徑;Masson染色分析膠原纖維的降解程度,并計(jì)算小鼠主動(dòng)脈膠原容積分?jǐn)?shù);EVG染色分析彈性纖維的降解程度;免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)主動(dòng)脈中、外膜中性粒細(xì)胞特異性標(biāo)記物L(fēng)y6G+的表達(dá)情況,定量分析各組小鼠主動(dòng)脈中性粒細(xì)胞含量差異。結(jié)果生存曲線結(jié)果顯示Model+NAC Group(23/25,92%)和Model Control Group(18/24,75%)兩組間小鼠生存率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.09);小動(dòng)物超聲結(jié)果顯示Model+NAC Group和Model Control Group兩組小鼠射血分?jǐn)?shù)(EF)和縮短分?jǐn)?shù)(FS)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(EF,P=0.43;FS,P=0.07);應(yīng)用micro-CT動(dòng)態(tài)觀察夾層小鼠主動(dòng)脈的變化過程,我們發(fā)現(xiàn)Model+NAC Group和Model Control Group小鼠升主動(dòng)脈變化差值(-0.087±0.064mm VS 0.075±0.055mm,P0.001)、主動(dòng)脈弓變化差值(-0.084±0.066mm VS 0.066±0.055mm,P0.001)相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而胸降主動(dòng)脈直徑變化差值(0.012±0.036mm VS 0.02±0.03mm,P=0.428)和腎上主動(dòng)脈直徑變化差值(-0.007±0.036mm VS 0.01±0.021mm,P=0.055)兩組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;Model+NAC Group(36%)小鼠嚴(yán)重主動(dòng)脈夾層(夾層和破裂)的發(fā)生率較Model Control Group(66.67%)顯著降低,兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.03);HE染色結(jié)果顯示Model+NAC Group小鼠升主動(dòng)脈直徑(1.52±0.35mm VS 1.77±0.43mm,P=0.027)和主動(dòng)脈弓直徑(1.34±0.18mm VS 1.47±0.26mm,P=0.039)明顯小于Model Control Group,而Model+NAC Group和Model Control Group小鼠胸降主動(dòng)脈直徑(1.16±0.12mm VS 1.20±0.29mm,P=0.54)和腎上主動(dòng)脈直徑(0.97±0.08mm VS0.99±0.08mm,P=0.45)之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;Model Control Group(3.00±0.78)和Model+NAC Group(2.64±0.86)小鼠主動(dòng)脈膠原纖維的降解程度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.09);Model Control Group(43.83±6.39%)和Model+NAC Group(54.37±6.59%)小鼠主動(dòng)脈膠原容積分?jǐn)?shù)明顯高于Sham Operation Group(20.60±3.08%),通過組間對(duì)比,Model+NAC Group(54.37±6.59%)小鼠主動(dòng)脈膠原容積分?jǐn)?shù)明顯高于Model Control Group(43.83±6.39%),兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);Model+NAC Group(2.96±0.81)和Model Control Group(2.76±0.88)小鼠主動(dòng)脈彈性纖維的降解程度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.37);Model+NAC Group(7.72±3.95%)小鼠主動(dòng)脈中性粒細(xì)胞含量明顯低于Model Control Group(10.04±4.43%),兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.037)。結(jié)論NAC可減輕夾層主動(dòng)脈的擴(kuò)張程度和嚴(yán)重程度,降低嚴(yán)重主動(dòng)脈夾層(夾層和破裂)發(fā)生率;NAC可促進(jìn)膠原在主動(dòng)脈中膜的沉積,降低中性粒細(xì)胞在主動(dòng)脈病變部位的浸潤(rùn)和聚集,促進(jìn)夾層模型小鼠主動(dòng)脈正向重構(gòu),在一定范圍內(nèi)影響夾層轉(zhuǎn)歸。
【學(xué)位單位】：中國(guó)人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R543.1
【部分圖文】：

軍軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文前 言主動(dòng)脈夾層（Aortic dissection, AD）指主動(dòng)脈內(nèi)膜處出現(xiàn)撕裂口，血液從主動(dòng)膜撕裂處進(jìn)入主動(dòng)脈中膜，使內(nèi)膜、中膜分離，沿主動(dòng)脈長(zhǎng)軸形成主動(dòng)脈壁的真腔[1-3]。隨著病情進(jìn)展，血液可沖破主動(dòng)脈壁，危及患者生命，甚至導(dǎo)致患者突亡，是一類十分兇險(xiǎn)的致死性主動(dòng)脈疾病[4, 5]。根據(jù) AD 起始撕裂口出現(xiàn)的位置和撕裂的累及范圍，AD 在臨床上主要有兩種方法，分別是 Stanford 分型和 De Bakey 分型（見圖 1-1）。

（4）在生物安全柜無菌條件下，拔下微泵針芯，用 27G 平針頭和 1 ml 注射器，按照微泵操作指南將 Ang II 溶液注入微泵，動(dòng)作輕柔，使微泵內(nèi)充滿 Ang II 溶液而沒有氣泡殘留；（5）將配好的微泵放入含生理鹽水的 15 ml 離心管中，37℃恒溫箱中過夜。3、血管緊張素 II/生理鹽水皮下微泵植入（1）戊巴比妥鈉溶于生理鹽水并混勻配制濃度為 1%的麻醉藥；（2）按 0.1 ml/10g 的劑量給予小鼠腹腔注射麻醉；（3）待小鼠角膜反射消失、四肢癱軟無力后將小鼠固定于手術(shù)臺(tái)上，剃去頸后毛發(fā)并以碘伏消毒；（4）于小鼠頸后皮膚消毒區(qū)剪開約 1 cm 橫行切口，擴(kuò)大皮下腔隙；（5）將 Ang II 微泵植入小鼠頸背部皮下腔隙內(nèi)，微泵開口朝向小鼠尾部；（6）使用帶針縫合線縫合切口；（7）待小鼠蘇醒后放回籠內(nèi)繼續(xù)飼養(yǎng)。

圖 1-3. Micro-CT 活體掃描：Skyscan1076 Micro-CT（A）；固定小鼠并將小鼠置于 CT 機(jī)載物臺(tái)上（B）Fig 1-3. Micro-CT living scanning: Skyscan1076 Micro-CT (A); An anesthetizedmouse was fixed and set on the object stage of the micro-CT apparatus (B)3、小鼠對(duì)比劑選 取 兩 種 常 用 小 動(dòng) 物 對(duì) 比 劑 ExiTron nano 12000 （ Miltenyi Biotec,Bergisch-Gladbach, Germany）和 eXIA 160XL（Binitio Biomedical, Canada），將 6 只小鼠隨機(jī)分為兩組，Ⅰ 組（ExiTron nano 12000 組）和Ⅱ 組（eXIA 160XL 組），將兩種對(duì)比劑分別通過尾靜脈注射到小鼠體內(nèi)，觀察并選擇主動(dòng)脈增強(qiáng)成像效果最佳的對(duì)比劑并用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。在我們實(shí)驗(yàn)中用于小鼠主動(dòng)脈成像的對(duì)比劑是 ExiTron nano 12000 和 eXIA160XL。ExiTron nano 是一種堿土金屬納米對(duì)比劑，專門用于臨床前的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究。對(duì)比劑納米顆粒被聚合物涂層包裹，其平均流體動(dòng)力學(xué)直徑為 110 nm，ExiTron nano12000 未經(jīng)稀釋對(duì)比劑的 CT 值約為 12000 HU。eXIA 160XL 對(duì)比劑是一種含高碘的
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本文編號(hào)：2870196