背景缺血性心臟病是嚴重威脅人類健康的重要心血管疾病之一。我們前期的研究顯示自噬在缺血預適應的心肌保護作用中發(fā)揮重要作用。但是缺血再灌注會因為誘發(fā)過度自噬而導致缺血再灌注損傷。缺血預適應這種短暫和輕微的氧化應激如何避免自噬性細胞死亡從而發(fā)揮心肌保護作用,目前還不是很清楚。我們的研究擬通過細胞和動物實驗探討缺血預適應是否通過動力相關(guān)蛋白1介導的線粒體自噬拯救缺血再灌注心肌的自噬清除。方法在細胞試驗中,H9C2心肌細胞成功轉(zhuǎn)染線粒體基質(zhì)靶向標記mito Ds Red(紅色)和自噬溶酶體標記CD63-GFP(綠色)后,我們應用H2O2培養(yǎng)基構(gòu)建構(gòu)建H9C2心肌細胞短暫輕微的氧化應激模型,應用營養(yǎng)饑餓培養(yǎng)基(HBSS)構(gòu)建H9C2心肌細胞非選擇性自噬模型,(1)檢測不同環(huán)境下ROS水平;(2)用激光共聚焦顯微鏡觀察線粒體形態(tài)及線粒體與自噬溶酶體的共定位;(3)用電子顯微鏡觀察細胞的超微結(jié)構(gòu)。然后用DRP1-si RNA沉默H9C2心肌細胞的DRP1表達,再次經(jīng)過上述H2O2和HBSS培養(yǎng)基處理,以Western blot analysis檢測細胞自噬底物蛋白水平。在離體動物實驗中,我們應用Langendorff-Perfusion動物模型,觀察Mi RNA499抑制DRP1去磷酸化對缺血再灌注心肌細胞自噬的影響。結(jié)果細胞實驗表明,H202可以使ROS適度升高,從而誘發(fā)線粒體自噬而不觸發(fā)非選擇性自噬。饑餓環(huán)境下可以同時誘導線粒體自噬和非選擇性自噬,而敲除DRP1的表達時,線粒體自噬被抑制,非選擇性自噬不受影響,說明DRP1介導了線粒體自噬過程。動物實驗表明Mi R499可以通過抑制DRP1的激活,減少IPC心肌的線粒體自噬水平,說明IPC是通過DRP1介導的線粒體自噬發(fā)揮作用的。結(jié)論適度升高的活性氧可以獨立誘導線粒體自噬,而不誘導非選擇性自噬。IPC通過Drp1介導的線粒體自噬減輕氧化應激和挽救缺血再灌注心肌的自噬清除。
【學位單位】：華中科技大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R54
【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 緒言
2 實驗研究
    2.1 實驗材料
    2.2 實驗裝置
    2.3 實驗方法
3 實驗結(jié)果
    3.1 ROS 流式檢測結(jié)果
    3.2 激光共聚焦和電子顯微鏡結(jié)果
    3.3 Western blot analysis
    3.4 Si RNA 轉(zhuǎn)染心肌細胞 P62、 LC3Western blot analysis
    3.5 離體大鼠心肌各組 DRP1、P62、 LC3B 濃度水平及 Western blotanalysis
4 結(jié)果分析與結(jié)論
    4.1 結(jié)果分析
    4.2 討論
致謝
參考文獻
綜述
    參考文獻

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本文編號：2854072