目的:動脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)是一種嚴(yán)重危害人類生命和健康常見疾病,目前已成為發(fā)達(dá)國家人口死亡的主要原因之一。AS是由于各種刺激因素作用于動脈血管壁引起的炎癥性疾病,是心腦血管病的主要誘因。然而AS在體內(nèi)的具體發(fā)生過程及原因還沒有清楚地解釋,因此探討其具體發(fā)病機(jī)制對心血管疾病的防治和人類的身體健康有重大意義。動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程與血管平滑肌細(xì)胞(Vascular Smooth Muscle Cells,VSMCs)功能的改變密切相關(guān)。VSMCs可以通過調(diào)節(jié)介質(zhì)如血小板衍生生長因子(Platelet Derived Growth Factor,PDGF)刺激從血管壁的中向內(nèi)膜遷移,這一改變是動脈粥樣硬化斑塊形成的重要步驟之一。Rho激酶(Rho-associated coiled-coil containing protein kinase,ROCK)屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白酶家族,在VSMCs的遷移和增殖過程中發(fā)揮重要作用,其機(jī)制主要是通過調(diào)控微絲骨架組裝和細(xì)胞的局部連接。然而,ROCK對AS發(fā)生過程中血管重構(gòu)的調(diào)節(jié)機(jī)制尚未完全明確。以往研究已經(jīng)證實(shí),微小RNA(miRNA)與AS的發(fā)生有密不可分的聯(lián)系。本研究擬通過培養(yǎng)人主動脈血管平滑肌細(xì)胞(Human Aortic Smooth Muscle Cells,AoSMCs),大鼠胸主動脈平滑肌細(xì)胞(A7r5)和大鼠原代胸主動脈細(xì)胞來探索miRNAs對ROCK調(diào)控的血管平滑肌細(xì)胞增殖遷移的影響及機(jī)制。方法:(1)使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction,qPCR)檢測利用ROCK的抑制劑Y27632處理A7r5后mi RNA-92a的變化;(2)利用si RNA干擾技術(shù),通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染ROCK/siRNA(siROCK),運(yùn)用qPCR檢測ROCK mRNA水平基因表達(dá)是否成功下調(diào);(3)使用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染miR-92a模擬物(Pre-miR-92a)和抑制劑(AntimiR-92a),在VSMCs中抑制或過表達(dá),運(yùn)用qPCR檢測miR-92a是否成功上調(diào)或下調(diào);(4)利用siRNA干擾技術(shù),對miR-92a進(jìn)行上調(diào)和下調(diào)后qPCR檢測ROCK mRNA的表達(dá)水平變化;(5)分別采用Boyden Chamber和CCK-8檢測miR-92a和ROCK對VSMCs遷移和增殖的影響;(6)利用CCK-8及Boyden Chamber方法檢測miR-92a靶基因哺乳動物轉(zhuǎn)錄因子4(Krüppel-like factor 4,KLF4)對VSMCs增殖和遷移的影響;(7)運(yùn)用Western blot檢測ROCK的抑制劑Y27632處理VSMCs后KLF4的表達(dá)情況;(8)運(yùn)用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)分析miR-92a和ROCK對VSMCs細(xì)胞偽足伸出情況和KLF4表達(dá)情況。結(jié)果:(1)ROCK抑制劑Y27632使miR-92a的表達(dá)下調(diào);(2)mi R-92a的模擬物和抑制劑對ROCK的表達(dá)量無明顯影響;(3)Anti-miR-92a可抑制由PDGF誘導(dǎo)的A7r5細(xì)胞的增殖和遷移,而Pre-miR-92a可以促進(jìn)A7r5細(xì)胞的增殖與遷移;(4)ROCK抑制劑Y27632可以抑制由PDGF誘導(dǎo)的A7r5細(xì)胞的增殖和遷移;(5)Pre-miR-92a可以恢復(fù)Y27632對VSMCs增殖和遷移的抑制作用;(6)KLF4可以抑制VSMCs的增殖和遷移;(7)Y27632使A7r5細(xì)胞中KLF4表達(dá)量增加;(8)在PDGF-BB刺激下,anti-miR-92a使KLF4表達(dá)量升高,并且抑制絲狀偽足形成。siROCK也可使KLF4表達(dá)量升高,抑制絲狀偽足形成;而pre-miR-92a可以部分抵消siROCK后的上述現(xiàn)象。結(jié)論:(1)ROCK和miR-92a均可以促進(jìn)VSMCs的增殖和遷移;(2)ROCK通過調(diào)控miR-92a促進(jìn)VSMCs的增殖和遷移;(3)ROCK通過miR-92a進(jìn)而作用于KLF4,以調(diào)控PDGF-BB介導(dǎo)的VSMC增殖和遷移。
【學(xué)位單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R543.5

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本文編號：2812939