發(fā)布時間：2020-09-03 19:14

　　 目的:當今社會,應激與疾病的關系越來越密切,長期暴露于各種社會心理應激狀態(tài)下,是心血管疾病發(fā)生的一個重要危險因素。有研究發(fā)現(xiàn)二肽基肽酶-Ⅳ(DPP-Ⅳ)能夠通過胰高血糖素-1(GLP-1)依賴與非依賴途徑參與體內多種疾病的發(fā)生與發(fā)展過程,包括炎癥性疾病、代謝綜合征以及心血管系統(tǒng)疾病。我們的前期研究發(fā)現(xiàn),慢性應激可以使血DPP-Ⅳ活性增加,從而引起一系列病理生理學改變。因此本研究目的如下:1)探討慢性應激在高脂飲食誘導ApoE基因敲除(ApoE-/-)小鼠動脈粥樣硬化形成中的作用及可能機制;2)研究DPP-Ⅳ/GLP-1平衡在慢性應激性動脈粥樣硬化形成過程中的變化;3.應用DPP-Ⅳ抑制劑(阿拉格列汀),闡明DPP-Ⅳ抑制劑的抗應激性動脈粥樣硬化作用及其機制。方法:一、動物實驗實驗1:實驗選取4周齡大小雄性ApoE基因敲除(ApoE-/-)小鼠30只,正常飲食、環(huán)境飼養(yǎng)2周。適應環(huán)境后隨機分為兩組,高脂飲食對照組(HF-C組,n=15只)僅給予高脂飲食,建立動脈粥樣硬化模型。高脂飲食應激組(HF-S組,n=15只),給予高脂飲食同時給予不同形式的慢性限制性應激刺激。實驗進行12周,留取兩組小鼠血液、骨髓、腹股溝區(qū)皮下脂肪、內臟脂肪、心臟及整個主動脈樣本。(1)應用HE染色、免疫組織化學染色、β-半乳糖((3-Gal)染色及油紅染色等方法評對比性應激對兩組小鼠動脈粥樣硬化斑塊面積、炎癥細胞浸潤、脂質聚集、細胞外基質(ECM)降解情況以及血管老化等多個方面的影響;(2)應用流式細胞術(FCM)評估慢性應激對骨髓祖細胞及造血干細胞的動員情況;(3)應用ELISA法測定兩組小鼠血脂聯(lián)素(APN)、瘦素、胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)等指標的水平;生化檢測低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、血肌酐、尿素氮和非酯化脂肪酸等指標;(4)應用氨基熒光素底物發(fā)光法測定血DPP-ⅣV活性,光澤精增強化學發(fā)光法測定NADPH活性;(5)應用PCR及Western Blot等方法測定GLP-1、APN、過氧化物酶體增殖體激活受體-α(PPAR-α)、血管緊張素ⅡⅠ型受體(ATR1)、CXC趨化因子受體4(CXCR4)、單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)、組織蛋白酶(Cat)K、CatS、NADPH氧化酶亞基(gp9lphox、P47phox、P67phox)、P-AMPK、P21、P16INK4A以及Toll樣受體2和4等相關指標基因蛋白表達情況;(6)應用明膠酶譜法測定基質金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9活性。實驗2:實驗選取4周齡大小雄性ApoE-/-小鼠28只,正常飲食、環(huán)境飼養(yǎng)2周。適應環(huán)境后隨機分為2組。所有實驗小鼠均給予高脂飲食飼養(yǎng)以形成動脈粥樣硬化模型。應激組(Sress組,n=14只)再給予不同形式的慢應激刺激12周。應激-DPP-Ⅳ抑制劑-阿拉格列汀組(S-Ana組,n=14只)給予應激刺激同時給予阿拉格列治療12周。留取兩組小鼠血液、骨髓、腹股溝區(qū)皮下脂肪、內臟脂肪、心臟及整個主動脈樣本,采取和實驗1同樣的方法進行結果分析。實驗3:實驗選取4周齡大小雄性ApoE-/-小鼠10只,正常飲食、環(huán)境飼養(yǎng)2周。適應環(huán)境后隨機分為2組。應激-阿拉格列汀-APN中和抗體組(S-Ana-NAPN組,n=5只)給予應激刺激和DPP-Ⅳ抑制劑基礎上每周2次皮下注射APN中和抗體8周。應激-阿拉格列汀-APN中和抗體對照組(S-Ana-C組,n=5只)小鼠給予應激刺激和DPP-Ⅳ抑制劑基礎上每周兩次皮下兔IgG抗體8周,留取兩組小鼠血液、骨髓、腹股溝區(qū)皮下脂肪、內臟脂肪、心臟及整個主動脈樣本,采取和實驗1同樣的方法進行生化和組織學分析。二、細胞實驗實驗選取3T3-L1細胞進行體外傳代及培養(yǎng)。細胞分為兩大組:GLP-1受體(GLP-1R)激動劑-艾塞那肽組和DPP-Ⅳ抑制劑組-阿拉格列汀組。GLP-1R激動劑組再分為三個亞組,分別給予GLP-1R激動劑-艾塞那肽OnM、5nM和25nM三個劑量刺激3T3-L1細胞;DPP-Ⅳ抑制劑組同樣分為三個亞組,分別給予阿拉格列汀0μM、10μM和20μM三個劑量刺激3T3-L1細胞。實驗結束,通過PCR檢測APN表達情況。結果:一、慢性應激對小鼠體重、血脂、體脂含量及血DPP-Ⅳ小平的影響。1.與HF-C組小鼠相比,HF-S組小鼠的體重明顯下降,且呈時間依賴性;同時,HF-S組小鼠皮下脂肪和內臟脂肪含量也明顯減少。HF-S組小鼠血DPP-Ⅳ水平(649±13ng/mLvs997±40ng/mL,P0.01)顯著增加,同時伴有血APN、GLP-1水平下降,差異具有統(tǒng)計學意義。2.兩組小鼠之間血CREA,BUN、LDL-C、HDL-C等指標水平沒有顯著性差異。二、慢性應激促進了飲食誘導的動脈粥樣硬化形成、斑塊不穩(wěn)定及血管老化。1.與HF-C組小鼠相比,慢性應激促進了高脂飲食誘導的小鼠主動脈根部動脈硬化粥樣斑塊形成,擴大了斑塊新生內膜面積(284±14×103/μm2 vs 557±21×103/μm2,P0.05),增加了斑塊內膜與中膜面積的比例(1.3±0.1vs2.3±0.2,P0.05),差異均具有統(tǒng)計學意義。2.慢性應激促進了斑塊內炎癥反應。免疫組似結果顯示:與非應激組比較,應激組小鼠斑塊內巨噬細胞、骨橋蛋白表達及新生血管數均明顯增加(22.8±1.7%vs34.5±2.4%;23.6±1.2%vs30.4±1.0%;5.6±0.9%vs9.3±1.3%;P 值均0.05);同時,炎癥相關指標 TLR-2、TLR-4、CXC趨化因子受體4(CXCR4)、組織蛋白酶(Cat)K、CatS、PPAR-α的基因表達也明顯增多。3.慢性應激促進了斑塊內氧化應激反應。還原性煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶活性檢測結果顯示:與HF-C組比較,HF-S組小鼠NADPH氧化酶活性明顯增加(130.2±7.8 RLU/mg vs.210.0±15.1RLU/mg,P0.05)。相應的NADPH氧化酶亞基(gp91phox、p47phox、P67phox)的基因或蛋白表達也明顯增高。4.慢性應激促進了細胞外基質(ECM)的降解。免疫組化結果顯示:與HF-C組比較,HF-S組小鼠動脈粥樣硬化斑塊內膠原纖維和平滑肌細胞含量明顯減少(32.1±1.3%vs 18.5±2.3%;27.3±1.0%vs24.4±0.6%;P值均0.05)。同時伴有MMP-2、MMP-9、CatK 和CatS的表達或活性的增強。5.慢性應激促進了血管的老化。β-Gal染色血管老化定量分析顯示,與HF-C組相比,慢性應激組小鼠血管老化染色陽性區(qū)域更加顯著(13.5±2.1×103/μm2 vs 33.5±3.5×103/μm2,P0.05);相應的,凋亡相關基因p16INK4A和p21的蛋白表達也明顯增強。三、DPP-Ⅳ抑制劑延緩了慢性應激所致的動脈粥樣硬化形成及血管老化過程。1.應用DPP-Ⅳ抑制劑-阿拉格列汀后明顯改善了應激性動脈粥樣硬化病變程度。與HF-C 組比較,DPP-Ⅳ抑制降低了血 DPP-Ⅳ水平(976±4ng/mLvs477±22ng/mL,P0.01),縮小了新生內膜面積(506.0×103/μm2±22.0 vs 147.0± 12.0×103/μm2,P0.05),差異均有統(tǒng)計學意義。2.與HF-C組相比,應用DPP-Ⅳ抑制劑后,顯著抑制了動脈粥樣硬化斑塊內巨噬細胞的浸潤、脂質沉積、新生血管的形成、彈性纖維的破壞,延緩了血管內皮的損傷及老化、并增加了斑塊內膠原纖維的含量。與此同時抑制了 TLR-2和TLR-4、CXCR4、CatS和CatK、骨橋蛋白、PPAR-α、基因p16INK4A、gp91phox、P47phox、P67phox等的mRNAs和/或蛋白的表達。差異均有統(tǒng)計學意義。3.APN中和抗體實驗結果顯示:應用APN中和抗體后抵消了 DPP-ⅣV抑制劑所帶來的抗應激性相關動脈粥樣硬化作用。與S-Ana-C組相比,S-Ana-NAPN組動脈粥樣硬化斑塊新生內膜面積及內/中膜比例更大(198±11 × 103 vs 392±23 × 103;0.9±0.1 vs 1.7±0.1,P 值均0.05)。四、GLP-1R激動劑促進了 3T3-L1細胞APN的表達。體外實驗發(fā)現(xiàn),GLP-1激動劑以劑量依賴方式促進了 3T3-L1脂肪細胞的APN表達。但DPP-Ⅳ抑制劑并不能直接刺激脂3T3-L1脂肪細胞的APN表達。結論:1.慢性應激促進了高脂飲食誘導的動脈粥樣硬化的發(fā)展進程。同時伴有血漿中DPP-Ⅳ和GLP-1失衡,提示血DPP-Ⅳ和GLP-1水平的變化可能成為應激相關心血管疾病的一個新的生物學標記物。2.DPP-Ⅳ抑制劑能夠在應激性動脈粥樣硬化及血管老化中發(fā)揮有益作用,而這些作用能夠被APN中和抗體減弱。提示DPP-Ⅳ抑制劑可能是通過改善GLP-1/GLP-1R-APN信號通路在應激性動脈粥樣硬化發(fā)展過程中發(fā)揮生物學作用。3.DPP-Ⅳ可能成為治療應激性心血管疾病的一個新的靶點。
【學位單位】：延邊大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R543.5

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本文編號：2811854