目的:當(dāng)今社會(huì),應(yīng)激與疾病的關(guān)系越來(lái)越密切,長(zhǎng)期暴露于各種社會(huì)心理應(yīng)激狀態(tài)下,是心血管疾病發(fā)生的一個(gè)重要危險(xiǎn)因素。有研究發(fā)現(xiàn)二肽基肽酶-Ⅳ(DPP-Ⅳ)能夠通過(guò)胰高血糖素-1(GLP-1)依賴與非依賴途徑參與體內(nèi)多種疾病的發(fā)生與發(fā)展過(guò)程,包括炎癥性疾病、代謝綜合征以及心血管系統(tǒng)疾病。我們的前期研究發(fā)現(xiàn),慢性應(yīng)激可以使血DPP-Ⅳ活性增加,從而引起一系列病理生理學(xué)改變。因此本研究目的如下:1)探討慢性應(yīng)激在高脂飲食誘導(dǎo)ApoE基因敲除(ApoE-/-)小鼠動(dòng)脈粥樣硬化形成中的作用及可能機(jī)制;2)研究DPP-Ⅳ/GLP-1平衡在慢性應(yīng)激性動(dòng)脈粥樣硬化形成過(guò)程中的變化;3.應(yīng)用DPP-Ⅳ抑制劑(阿拉格列汀),闡明DPP-Ⅳ抑制劑的抗應(yīng)激性動(dòng)脈粥樣硬化作用及其機(jī)制。方法:一、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)1:實(shí)驗(yàn)選取4周齡大小雄性ApoE基因敲除(ApoE-/-)小鼠30只,正常飲食、環(huán)境飼養(yǎng)2周。適應(yīng)環(huán)境后隨機(jī)分為兩組,高脂飲食對(duì)照組(HF-C組,n=15只)僅給予高脂飲食,建立動(dòng)脈粥樣硬化模型。高脂飲食應(yīng)激組(HF-S組,n=15只),給予高脂飲食同時(shí)給予不同形式的慢性限制性應(yīng)激刺激。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行12周,留取兩組小鼠血液、骨髓、腹股溝區(qū)皮下脂肪、內(nèi)臟脂肪、心臟及整個(gè)主動(dòng)脈樣本。(1)應(yīng)用HE染色、免疫組織化學(xué)染色、β-半乳糖((3-Gal)染色及油紅染色等方法評(píng)對(duì)比性應(yīng)激對(duì)兩組小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、脂質(zhì)聚集、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)降解情況以及血管老化等多個(gè)方面的影響;(2)應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)評(píng)估慢性應(yīng)激對(duì)骨髓祖細(xì)胞及造血干細(xì)胞的動(dòng)員情況;(3)應(yīng)用ELISA法測(cè)定兩組小鼠血脂聯(lián)素(APN)、瘦素、胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)等指標(biāo)的水平;生化檢測(cè)低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、血肌酐、尿素氮和非酯化脂肪酸等指標(biāo);(4)應(yīng)用氨基熒光素底物發(fā)光法測(cè)定血DPP-ⅣV活性,光澤精增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法測(cè)定NADPH活性;(5)應(yīng)用PCR及Western Blot等方法測(cè)定GLP-1、APN、過(guò)氧化物酶體增殖體激活受體-α(PPAR-α)、血管緊張素ⅡⅠ型受體(ATR1)、CXC趨化因子受體4(CXCR4)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)、組織蛋白酶(Cat)K、CatS、NADPH氧化酶亞基(gp9lphox、P47phox、P67phox)、P-AMPK、P21、P16INK4A以及Toll樣受體2和4等相關(guān)指標(biāo)基因蛋白表達(dá)情況;(6)應(yīng)用明膠酶譜法測(cè)定基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9活性。實(shí)驗(yàn)2:實(shí)驗(yàn)選取4周齡大小雄性ApoE-/-小鼠28只,正常飲食、環(huán)境飼養(yǎng)2周。適應(yīng)環(huán)境后隨機(jī)分為2組。所有實(shí)驗(yàn)小鼠均給予高脂飲食飼養(yǎng)以形成動(dòng)脈粥樣硬化模型。應(yīng)激組(Sress組,n=14只)再給予不同形式的慢應(yīng)激刺激12周。應(yīng)激-DPP-Ⅳ抑制劑-阿拉格列汀組(S-Ana組,n=14只)給予應(yīng)激刺激同時(shí)給予阿拉格列治療12周。留取兩組小鼠血液、骨髓、腹股溝區(qū)皮下脂肪、內(nèi)臟脂肪、心臟及整個(gè)主動(dòng)脈樣本,采取和實(shí)驗(yàn)1同樣的方法進(jìn)行結(jié)果分析。實(shí)驗(yàn)3:實(shí)驗(yàn)選取4周齡大小雄性ApoE-/-小鼠10只,正常飲食、環(huán)境飼養(yǎng)2周。適應(yīng)環(huán)境后隨機(jī)分為2組。應(yīng)激-阿拉格列汀-APN中和抗體組(S-Ana-NAPN組,n=5只)給予應(yīng)激刺激和DPP-Ⅳ抑制劑基礎(chǔ)上每周2次皮下注射APN中和抗體8周。應(yīng)激-阿拉格列汀-APN中和抗體對(duì)照組(S-Ana-C組,n=5只)小鼠給予應(yīng)激刺激和DPP-Ⅳ抑制劑基礎(chǔ)上每周兩次皮下兔IgG抗體8周,留取兩組小鼠血液、骨髓、腹股溝區(qū)皮下脂肪、內(nèi)臟脂肪、心臟及整個(gè)主動(dòng)脈樣本,采取和實(shí)驗(yàn)1同樣的方法進(jìn)行生化和組織學(xué)分析。二、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)選取3T3-L1細(xì)胞進(jìn)行體外傳代及培養(yǎng)。細(xì)胞分為兩大組:GLP-1受體(GLP-1R)激動(dòng)劑-艾塞那肽組和DPP-Ⅳ抑制劑組-阿拉格列汀組。GLP-1R激動(dòng)劑組再分為三個(gè)亞組,分別給予GLP-1R激動(dòng)劑-艾塞那肽OnM、5nM和25nM三個(gè)劑量刺激3T3-L1細(xì)胞;DPP-Ⅳ抑制劑組同樣分為三個(gè)亞組,分別給予阿拉格列汀0μM、10μM和20μM三個(gè)劑量刺激3T3-L1細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)束,通過(guò)PCR檢測(cè)APN表達(dá)情況。結(jié)果:一、慢性應(yīng)激對(duì)小鼠體重、血脂、體脂含量及血DPP-Ⅳ小平的影響。1.與HF-C組小鼠相比,HF-S組小鼠的體重明顯下降,且呈時(shí)間依賴性;同時(shí),HF-S組小鼠皮下脂肪和內(nèi)臟脂肪含量也明顯減少。HF-S組小鼠血DPP-Ⅳ水平(649±13ng/mLvs997±40ng/mL,P0.01)顯著增加,同時(shí)伴有血APN、GLP-1水平下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.兩組小鼠之間血CREA,BUN、LDL-C、HDL-C等指標(biāo)水平?jīng)]有顯著性差異。二、慢性應(yīng)激促進(jìn)了飲食誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化形成、斑塊不穩(wěn)定及血管老化。1.與HF-C組小鼠相比,慢性應(yīng)激促進(jìn)了高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠主動(dòng)脈根部動(dòng)脈硬化粥樣斑塊形成,擴(kuò)大了斑塊新生內(nèi)膜面積(284±14×103/μm2 vs 557±21×103/μm2,P0.05),增加了斑塊內(nèi)膜與中膜面積的比例(1.3±0.1vs2.3±0.2,P0.05),差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.慢性應(yīng)激促進(jìn)了斑塊內(nèi)炎癥反應(yīng)。免疫組似結(jié)果顯示:與非應(yīng)激組比較,應(yīng)激組小鼠斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞、骨橋蛋白表達(dá)及新生血管數(shù)均明顯增加(22.8±1.7%vs34.5±2.4%;23.6±1.2%vs30.4±1.0%;5.6±0.9%vs9.3±1.3%;P 值均0.05);同時(shí),炎癥相關(guān)指標(biāo) TLR-2、TLR-4、CXC趨化因子受體4(CXCR4)、組織蛋白酶(Cat)K、CatS、PPAR-α的基因表達(dá)也明顯增多。3.慢性應(yīng)激促進(jìn)了斑塊內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)。還原性煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示:與HF-C組比較,HF-S組小鼠NADPH氧化酶活性明顯增加(130.2±7.8 RLU/mg vs.210.0±15.1RLU/mg,P0.05)。相應(yīng)的NADPH氧化酶亞基(gp91phox、p47phox、P67phox)的基因或蛋白表達(dá)也明顯增高。4.慢性應(yīng)激促進(jìn)了細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的降解。免疫組化結(jié)果顯示:與HF-C組比較,HF-S組小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)膠原纖維和平滑肌細(xì)胞含量明顯減少(32.1±1.3%vs 18.5±2.3%;27.3±1.0%vs24.4±0.6%;P值均0.05)。同時(shí)伴有MMP-2、MMP-9、CatK 和CatS的表達(dá)或活性的增強(qiáng)。5.慢性應(yīng)激促進(jìn)了血管的老化。β-Gal染色血管老化定量分析顯示,與HF-C組相比,慢性應(yīng)激組小鼠血管老化染色陽(yáng)性區(qū)域更加顯著(13.5±2.1×103/μm2 vs 33.5±3.5×103/μm2,P0.05);相應(yīng)的,凋亡相關(guān)基因p16INK4A和p21的蛋白表達(dá)也明顯增強(qiáng)。三、DPP-Ⅳ抑制劑延緩了慢性應(yīng)激所致的動(dòng)脈粥樣硬化形成及血管老化過(guò)程。1.應(yīng)用DPP-Ⅳ抑制劑-阿拉格列汀后明顯改善了應(yīng)激性動(dòng)脈粥樣硬化病變程度。與HF-C 組比較,DPP-Ⅳ抑制降低了血 DPP-Ⅳ水平(976±4ng/mLvs477±22ng/mL,P0.01),縮小了新生內(nèi)膜面積(506.0×103/μm2±22.0 vs 147.0± 12.0×103/μm2,P0.05),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.與HF-C組相比,應(yīng)用DPP-Ⅳ抑制劑后,顯著抑制了動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)、脂質(zhì)沉積、新生血管的形成、彈性纖維的破壞,延緩了血管內(nèi)皮的損傷及老化、并增加了斑塊內(nèi)膠原纖維的含量。與此同時(shí)抑制了 TLR-2和TLR-4、CXCR4、CatS和CatK、骨橋蛋白、PPAR-α、基因p16INK4A、gp91phox、P47phox、P67phox等的mRNAs和/或蛋白的表達(dá)。差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.APN中和抗體實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:應(yīng)用APN中和抗體后抵消了 DPP-ⅣV抑制劑所帶來(lái)的抗應(yīng)激性相關(guān)動(dòng)脈粥樣硬化作用。與S-Ana-C組相比,S-Ana-NAPN組動(dòng)脈粥樣硬化斑塊新生內(nèi)膜面積及內(nèi)/中膜比例更大(198±11 × 103 vs 392±23 × 103;0.9±0.1 vs 1.7±0.1,P 值均0.05)。四、GLP-1R激動(dòng)劑促進(jìn)了 3T3-L1細(xì)胞APN的表達(dá)。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),GLP-1激動(dòng)劑以劑量依賴方式促進(jìn)了 3T3-L1脂肪細(xì)胞的APN表達(dá)。但DPP-Ⅳ抑制劑并不能直接刺激脂3T3-L1脂肪細(xì)胞的APN表達(dá)。結(jié)論:1.慢性應(yīng)激促進(jìn)了高脂飲食誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展進(jìn)程。同時(shí)伴有血漿中DPP-Ⅳ和GLP-1失衡,提示血DPP-Ⅳ和GLP-1水平的變化可能成為應(yīng)激相關(guān)心血管疾病的一個(gè)新的生物學(xué)標(biāo)記物。2.DPP-Ⅳ抑制劑能夠在應(yīng)激性動(dòng)脈粥樣硬化及血管老化中發(fā)揮有益作用,而這些作用能夠被APN中和抗體減弱。提示DPP-Ⅳ抑制劑可能是通過(guò)改善GLP-1/GLP-1R-APN信號(hào)通路在應(yīng)激性動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮生物學(xué)作用。3.DPP-Ⅳ可能成為治療應(yīng)激性心血管疾病的一個(gè)新的靶點(diǎn)。
【學(xué)位單位】：延邊大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R543.5

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本文編號(hào)：2811854