【目的】雖然急性B淋巴細胞白血病和B細胞惡性淋巴瘤的治療效果取得了很大提高,但是仍然有一部分患者是復發(fā)難治的。靶向CD19嵌合抗原受體(CAR19)T細胞療法引起了前所未有的治療效果。然而,CD19陰性復發(fā)是CAR-T治療失敗的最常見原因,并且缺乏有效的治療手段,因此需要我們尋找新的治療方法。我們分別構(gòu)建了靶向CD19和CD22的第三代CAR慢病毒載體,在體內(nèi)外驗證了有效性和安全性。在本中心,我們進行了一項開放標簽,單中心和單臂臨床試驗研究,以探索聯(lián)合序貫輸注抗CD19和CD22 CART治療r/r B-ALL/NHL患者的療效和安全性�！痉椒ā繕�(gòu)建靶向CD19和CD22 CAR的慢病毒載體,共轉(zhuǎn)染到293T細胞中包裝慢病毒。磁珠分選供者的CD3+T細胞后進行慢病毒轉(zhuǎn)導,在體外大量擴增并檢測病毒轉(zhuǎn)染效率和凋亡比例。另外進行體外殺瘤實驗,細胞因子分泌,CD107a表達等實驗,來驗證CD19和CD22 CART細胞的體外功能;在NSG異種移植小鼠模型中驗證CD19和CD22 CART細胞在體內(nèi)的殺傷腫瘤效應。89例難治復發(fā)的B-ALL/B-NHL患者入組參加本中心聯(lián)合序貫輸注抗CD19和CD22CART治療的臨床試驗。統(tǒng)計分析患者的診療經(jīng)過,以系統(tǒng)評估二者聯(lián)合應用的安全性和有效性。對患者的遺傳學因素和其他臨床參數(shù)進行分析,探索其對CAR-T細胞療法的預后價值�！窘Y(jié)果】成功構(gòu)建了第三代抗CD19 CAR和CD22 CAR,穩(wěn)定高效地在T細胞上表達,凋亡水平無明顯增加。檢測體外殺瘤效應,細胞因子分泌以及CD107a表達,都顯示了CAR-T細胞良好的功能。抗CD19 CAR-T和CD22 CAR-T細胞在體內(nèi)也展現(xiàn)了良好的殺傷腫瘤效應,而且不引起治療相關毒性反應。在體外功能方面,CD19 CAR-T和CD22CAR-T細胞之間均無明顯差異。51例B-ALL的隊列中,MRD陰性反應率為96.0%(95%置信區(qū)間(CI),86.3至99.5)。中位隨訪時間為7.6個月,中位PFS為12.0個月(95%CI,5.4至18.6),未達到中位OS(NR)(95%CI,10.1至NR)。38例B-NHL的隊列中,總有效率為72.2%(95%CI,54.8~85.8),完全緩解率為50.0%(95%CI,32.9~67.1)。中位隨訪時間為5.3個月,中位PFS為5.8個月(95%CI,3.3至NR),中位OS為NR(95%CI,6.1至NR)。CAR19/22 T細胞治療后未檢測到CD19或CD22的丟失。重度CRS和CRES發(fā)生率分別為22.4%和13.5%。除一例外,均可逆轉(zhuǎn)�！窘Y(jié)論】第三代抗CD19 CAR-T和CD22 CAR-T細胞,在體內(nèi)外是安全,有效和特異的。聯(lián)合序貫輸注CAR19/CAR22 T細胞治療B細胞惡性腫瘤是有效且安全的,并且可以克服CD19/CD22靶向治療中的抗原丟失復發(fā)問題。
【學位單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R730.51;R733
【部分圖文】：

華 中 科 技 大 學 博 士 學 位 論 文結(jié)果1、 構(gòu)建抗 CD19 和 CD22 PLVX-EF1a-CAR 慢病毒質(zhì)粒CAR 由胞外域、跨膜域和胞內(nèi)區(qū)三個部分組成.利用基因合成的方法，將信號肽，鼠源 anti-CD19 和 anti-CD22 的 scfv 分別與 CD8 鉸鏈區(qū)，CD28 跨膜域，共刺激分子CD28 和 CD137,激活信號 CD3-zeta 按順序串聯(lián)起來，并構(gòu)建到 PLVX 慢病毒載體中（圖 1A,1B）。經(jīng)一代測序后，序列比對完全正確，最終獲得了成功構(gòu)建的 anti-CD19和 anti-CD22 CAR 慢病毒質(zhì)粒。

圖 2. CD19 CAR-T 和 CD22 CAR-T 轉(zhuǎn)效及凋亡以上結(jié)果表明，成功包裝的抗 CD19 CAR 和 CD22 CAR 慢病毒，能夠在健患者來源的 CD3+T 細胞上表達，可以獲得高效穩(wěn)定的病毒轉(zhuǎn)染效率，并且及培養(yǎng)后 CAR-T 細胞凋亡水平無明顯增加。 CART 細胞體外殺瘤實驗效應測定Raji 細胞是 B 系淋巴瘤細胞系，表達 CD19 和 CD22 抗原，而 K562 細胞是血病細胞，不表達表達 CD19 和 CD22 抗原。CD19 CAR-T 和 CD22 CAR-T特異性地殺傷 Raji 細胞，而對 K562 細胞無明顯殺瘤作用。以 50:1, 10:1, 2:1靶比例，未轉(zhuǎn)染對照 T 細胞，CD19 CAR-T 和 CD22 CAR-T 細胞分別與 R K562 細胞共培養(yǎng) 24 小時后，運用鈣黃綠素-AM 釋放法檢測 CAR-T 細胞體應。殺瘤結(jié)果顯示，四種效靶比下，未轉(zhuǎn)染 T 細胞（control T）對 Raji 細胞

1.52%±0.57%； CD19 CAR-T 對 Raji 細胞的殺瘤效率分別為 92.47%±6.29%、64.56%±4.25%、31.37%±2.58 %、14.39%±2.81%，對 K562 細胞的殺瘤效率分別為11.75%±4.12%、 6.42%±3.23%、 3.37%±1.44%、1.81%±0.35%；CD22 CAR-T 對Raji 細胞的殺瘤效率分別為 95.23%±4.39% 、 73.05%±4.18% 、 34.22%±3.43% 、13.66%±1.15%，對 K562 細胞的殺瘤效率分別為 14.20%±6.49%、8.72%±3.22%、3.06%±1.44%、1.21%±0.43%（圖 3A,3B）。比較四個比例下，CD19 CAR-T 和 CD22 CAR-T 細胞對 Raji 細胞或 K562 細胞的殺瘤效率，統(tǒng)計學分析后發(fā)現(xiàn) CD19 CAR-T 和 CD22 CAR-T 細胞兩者之間差異無統(tǒng)計學意義（p>0.05）。以上結(jié)果表明，CD19 CAR-T 和 CD22 CAR-T 細胞對 CD19 或 CD22 陽性靶細胞具有很好的殺傷效果，即使是在低效靶比的情況下，依然能夠顯示出相當好的殺瘤效應。并且都顯示了良好的殺傷特異性，幾乎不對 CD19 或 CD22 陰性靶細胞產(chǎn)生殺傷效應。另外，兩者在體外的腫瘤殺傷能力相近，有利于后續(xù)比較二者在體內(nèi)的功能。

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本文編號：2811411