研究背景在臨床診療中,不穩(wěn)定型心絞痛的病情變化十分不穩(wěn)定,在負(fù)荷時(shí)、休息時(shí)均可發(fā)作。冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂和血栓形成是導(dǎo)致不穩(wěn)定型心絞痛的原因,它們的發(fā)生均與內(nèi)皮細(xì)胞的功能紊亂相關(guān)。目前,不穩(wěn)定型心絞痛缺乏快速、特異、有效的檢測(cè)指標(biāo),使早期診斷難以準(zhǔn)確,只能靠傳統(tǒng)指標(biāo)做出臨床疑似診斷。因此,如何快速診斷不穩(wěn)定型心絞痛仍有研究意義。在研究的前期,我們通過RT-PCR技術(shù)檢測(cè)到,與疑似不穩(wěn)定型心絞痛的非冠心病患者相比,不穩(wěn)定型心絞痛患者的血清中miR-499a-3p的表達(dá)量明顯增高,然后,通過Target scan預(yù)測(cè)ADAM10為miR-499a-3p的下游靶基因。同時(shí),使用熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)檢測(cè),發(fā)現(xiàn)miR-499a-3p與ADAM10存在負(fù)性的靶向調(diào)控關(guān)系。研究目的:(1)在前期研究基礎(chǔ)上,探討miR-499a-3p對(duì)原代HUVEC功能的影響;(2)驗(yàn)證miR-499a-3p是否參與原代HUVEC調(diào)控ADAM10的表達(dá)。研究方法:使用原代HUVEC代替人冠狀動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞,將原代HUVEC按轉(zhuǎn)染慢病毒類型分為四組,即未轉(zhuǎn)染病毒的原代HUVEC為空白組(NC組)、轉(zhuǎn)染CO137陰性病毒的原代HUVEC為miR-NC組(空載組)、轉(zhuǎn)染miR-499a的原代HUVEC為miR-499a-3p mimics組(上調(diào)組)及轉(zhuǎn)染miR-499a-3p inhibitors的原代HUVEC為miR-499a-3p inhibitors組(下調(diào)組)。構(gòu)建攜帶慢病毒miR-499a-3p高表達(dá)或低表達(dá)的原代HUVEC穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株。然后,使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)四組原代HUVEC中miR-499a-3p及ADAM10的表達(dá)量。運(yùn)用蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)四組原代HUVEC中ADAM10的表達(dá)量。然后,運(yùn)用劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)、CCK8實(shí)驗(yàn)明確空白組、miR-NC組、miR-499a-3p mimics組和miR-499a-3p inhibitors組中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的原代HUVEC的增殖、遷移能力變化。運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)明確空白組、miR-NC組、miR-499a-3p mimics組和miR-499a-3p inhibitors組中原代HUVEC凋亡情況。研究結(jié)果:(1)慢病毒轉(zhuǎn)染預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果:轉(zhuǎn)染慢病毒至原代HUVEC的最適合的MOI為10及轉(zhuǎn)染最適合的條件為慢病毒+內(nèi)皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基;(2)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的篩選結(jié)果顯示:嘌呤霉素溶液篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的最合適濃度為2μg/mL。(3)RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果:空白組與miR-NC組的HUVEC中miR-499a-3p及ADAM10的表達(dá)量無(wú)顯著差異(P㧐0.05)。與空白組和miR-NC組相比,miR-499a-3p mimics組細(xì)胞中miR-499a-3p的表達(dá)量明顯升高(P0.01),ADAM10明顯降低(P0.05)。在miR-499a-3p inhibitors組細(xì)胞中miR-499a-3p的表達(dá)量明顯降低(P0.05),ADAM10明顯升高(P0.05)。(4)蛋白免疫印跡試驗(yàn)結(jié)果:與空白組和miR-NC組相比,miR-499a-3p mimics組細(xì)胞中ADAM10蛋白表達(dá)明顯降低(P0.05);miR-499a-3p inhibitors組細(xì)胞中ADAM10蛋白明顯升高(P0.05)。(5)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果:與空白組和miR-NC組相比,原代HUVEC穩(wěn)定轉(zhuǎn)染miR-499a-3p mimics后,遷移細(xì)胞數(shù)量減少,遷移能力受到顯著抑制(P0.05);而穩(wěn)轉(zhuǎn)miR-499a-3p inhibitors后,遷移細(xì)胞數(shù)量增加,遷移能力受到顯著增強(qiáng)(P0.05)。(6)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果:與空白組和miR-NC組相比,miR-499a-3p mimics組凋亡細(xì)胞總數(shù)明顯增高(P0.05)。miR-499a-3p inhibitors組凋亡細(xì)胞總數(shù)明顯減少(P0.05)。表明:miR-499a-3p能誘導(dǎo)原代HUVEC的凋亡。研究結(jié)論:(1)慢病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株構(gòu)建成功。(2)在四組實(shí)驗(yàn)細(xì)胞中,miR-499a-3p表達(dá)上調(diào)會(huì)抑制ADAM10的表達(dá)miR-499a-3p抑制原代HUVEC的增殖、遷移能力,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。其機(jī)制可能與ADAM10蛋白的表達(dá)相關(guān)。內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂與AS和血栓形成的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),AS的破裂和血栓形成是導(dǎo)致不穩(wěn)定型心絞痛的原因。故在前期研究結(jié)果的基礎(chǔ)上,根據(jù)本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果推測(cè),miR-499a-3p與ADAM10之間的作用參與UA的發(fā)生發(fā)展。檢測(cè)miR-499a-3p的表達(dá)有望成為UA新的早期診斷生物標(biāo)記物,為避免惡性冠脈事件的發(fā)生提供了潛在的干預(yù)靶點(diǎn)。
【學(xué)位單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R541.4
【部分圖文】：

47注：圖 A 為流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡的情況圖，圖片 B 為流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)后，各組凋亡細(xì)胞的占總細(xì)胞的百分比的統(tǒng)計(jì)值圖。兩圖片中 NC、miR-NC、miR-499a-3p mimics、miR-499a-3p inhibitors所代表組與其他圖相同。圖 B 中顯示,與 NC 組比較，miR-499a-3p mimics 中，凋亡的細(xì)胞百分比增高（*P＜0.05）； miR-499a-3p inhibitors 中，凋亡的細(xì)胞百分比降低（*P＜0.05）。圖 3-10 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)結(jié)果Note. FigureAis a graph of cell apoptosis detected by flow cytometry, and panel B is a graph of thepercentage of total cells in each group of apoptotic cells after flow cytometry. The groups represented by

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本文編號(hào)：2808233