研究背景在臨床診療中,不穩(wěn)定型心絞痛的病情變化十分不穩(wěn)定,在負荷時、休息時均可發(fā)作。冠狀動脈粥樣硬化斑塊破裂和血栓形成是導致不穩(wěn)定型心絞痛的原因,它們的發(fā)生均與內(nèi)皮細胞的功能紊亂相關(guān)。目前,不穩(wěn)定型心絞痛缺乏快速、特異、有效的檢測指標,使早期診斷難以準確,只能靠傳統(tǒng)指標做出臨床疑似診斷。因此,如何快速診斷不穩(wěn)定型心絞痛仍有研究意義。在研究的前期,我們通過RT-PCR技術(shù)檢測到,與疑似不穩(wěn)定型心絞痛的非冠心病患者相比,不穩(wěn)定型心絞痛患者的血清中miR-499a-3p的表達量明顯增高,然后,通過Target scan預測ADAM10為miR-499a-3p的下游靶基因。同時,使用熒光素酶報告基因技術(shù)檢測,發(fā)現(xiàn)miR-499a-3p與ADAM10存在負性的靶向調(diào)控關(guān)系。研究目的:(1)在前期研究基礎(chǔ)上,探討miR-499a-3p對原代HUVEC功能的影響;(2)驗證miR-499a-3p是否參與原代HUVEC調(diào)控ADAM10的表達。研究方法:使用原代HUVEC代替人冠狀動脈血管內(nèi)皮細胞,將原代HUVEC按轉(zhuǎn)染慢病毒類型分為四組,即未轉(zhuǎn)染病毒的原代HUVEC為空白組(NC組)、轉(zhuǎn)染CO137陰性病毒的原代HUVEC為miR-NC組(空載組)、轉(zhuǎn)染miR-499a的原代HUVEC為miR-499a-3p mimics組(上調(diào)組)及轉(zhuǎn)染miR-499a-3p inhibitors的原代HUVEC為miR-499a-3p inhibitors組(下調(diào)組)。構(gòu)建攜帶慢病毒miR-499a-3p高表達或低表達的原代HUVEC穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株。然后,使用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測四組原代HUVEC中miR-499a-3p及ADAM10的表達量。運用蛋白質(zhì)印跡實驗檢測四組原代HUVEC中ADAM10的表達量。然后,運用劃痕實驗、Transwell實驗、CCK8實驗明確空白組、miR-NC組、miR-499a-3p mimics組和miR-499a-3p inhibitors組中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的原代HUVEC的增殖、遷移能力變化。運用流式細胞術(shù)明確空白組、miR-NC組、miR-499a-3p mimics組和miR-499a-3p inhibitors組中原代HUVEC凋亡情況。研究結(jié)果:(1)慢病毒轉(zhuǎn)染預實驗結(jié)果:轉(zhuǎn)染慢病毒至原代HUVEC的最適合的MOI為10及轉(zhuǎn)染最適合的條件為慢病毒+內(nèi)皮細胞完全培養(yǎng)基;(2)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株的篩選結(jié)果顯示:嘌呤霉素溶液篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞的最合適濃度為2μg/mL。(3)RT-PCR實驗結(jié)果:空白組與miR-NC組的HUVEC中miR-499a-3p及ADAM10的表達量無顯著差異(P㧐0.05)。與空白組和miR-NC組相比,miR-499a-3p mimics組細胞中miR-499a-3p的表達量明顯升高(P0.01),ADAM10明顯降低(P0.05)。在miR-499a-3p inhibitors組細胞中miR-499a-3p的表達量明顯降低(P0.05),ADAM10明顯升高(P0.05)。(4)蛋白免疫印跡試驗結(jié)果:與空白組和miR-NC組相比,miR-499a-3p mimics組細胞中ADAM10蛋白表達明顯降低(P0.05);miR-499a-3p inhibitors組細胞中ADAM10蛋白明顯升高(P0.05)。(5)細胞劃痕實驗、Transwell實驗、細胞增殖實驗結(jié)果:與空白組和miR-NC組相比,原代HUVEC穩(wěn)定轉(zhuǎn)染miR-499a-3p mimics后,遷移細胞數(shù)量減少,遷移能力受到顯著抑制(P0.05);而穩(wěn)轉(zhuǎn)miR-499a-3p inhibitors后,遷移細胞數(shù)量增加,遷移能力受到顯著增強(P0.05)。(6)流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡實驗結(jié)果:與空白組和miR-NC組相比,miR-499a-3p mimics組凋亡細胞總數(shù)明顯增高(P0.05)。miR-499a-3p inhibitors組凋亡細胞總數(shù)明顯減少(P0.05)。表明:miR-499a-3p能誘導原代HUVEC的凋亡。研究結(jié)論:(1)慢病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株構(gòu)建成功。(2)在四組實驗細胞中,miR-499a-3p表達上調(diào)會抑制ADAM10的表達miR-499a-3p抑制原代HUVEC的增殖、遷移能力,誘導細胞凋亡。其機制可能與ADAM10蛋白的表達相關(guān)。內(nèi)皮細胞功能紊亂與AS和血栓形成的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),AS的破裂和血栓形成是導致不穩(wěn)定型心絞痛的原因。故在前期研究結(jié)果的基礎(chǔ)上,根據(jù)本實驗的研究結(jié)果推測,miR-499a-3p與ADAM10之間的作用參與UA的發(fā)生發(fā)展。檢測miR-499a-3p的表達有望成為UA新的早期診斷生物標記物,為避免惡性冠脈事件的發(fā)生提供了潛在的干預靶點。
【學位單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R541.4
【部分圖文】：

47注：圖 A 為流式細胞技術(shù)檢測細胞凋亡的情況圖，圖片 B 為流式細胞技術(shù)檢測后，各組凋亡細胞的占總細胞的百分比的統(tǒng)計值圖。兩圖片中 NC、miR-NC、miR-499a-3p mimics、miR-499a-3p inhibitors所代表組與其他圖相同。圖 B 中顯示,與 NC 組比較，miR-499a-3p mimics 中，凋亡的細胞百分比增高（*P＜0.05）； miR-499a-3p inhibitors 中，凋亡的細胞百分比降低（*P＜0.05）。圖 3-10 流式細胞技術(shù)檢測結(jié)果Note. FigureAis a graph of cell apoptosis detected by flow cytometry, and panel B is a graph of thepercentage of total cells in each group of apoptotic cells after flow cytometry. The groups represented by

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本文編號：2808233