【摘要】：背景核仁是位于細(xì)胞核中的一個(gè)非膜性細(xì)胞器,是核糖體生物合成的場(chǎng)所,在細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成以及細(xì)胞的增殖、分化與衰老等生命活動(dòng)中發(fā)揮重要作用。最近的研究表明,核仁還可以感受細(xì)胞的應(yīng)激刺激,參與細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng),稱(chēng)為核仁應(yīng)激。在結(jié)構(gòu)上,應(yīng)激后的核仁主要有兩個(gè)方面的變化：完整核仁結(jié)構(gòu)瓦解,一些核仁蛋白(如NPM和NS)從核仁轉(zhuǎn)位到核質(zhì)。Nucleostemin(NPM)是核仁特異性的蛋白,正常情況下只定位于核仁中,核仁應(yīng)激時(shí)從核仁轉(zhuǎn)位到核質(zhì),起到感受細(xì)胞應(yīng)激的作用,NPM蛋白轉(zhuǎn)位到核質(zhì),被認(rèn)為是核仁應(yīng)激的標(biāo)志性事件。在細(xì)胞功能方面,目前認(rèn)為核仁應(yīng)激發(fā)生一個(gè)主要作用是改變細(xì)胞腫瘤抑制因子P53的穩(wěn)定性,核仁應(yīng)激通過(guò)阻斷P53結(jié)合E3泛素連接酶MDM2,導(dǎo)致P53泛素化下降和活性降低,引起P53降解減少積累增加。新出現(xiàn)的證據(jù)表明,核仁應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生可能與心血管疾病和神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)系。值得注意的是,有研究報(bào)道,輻射誘導(dǎo)的DNA損傷本身不能觸發(fā)P53穩(wěn)定性變化,除非核仁結(jié)構(gòu)也被破壞了；此外,迫使核仁瓦解在無(wú)基因毒性應(yīng)激時(shí)也能改變P53的穩(wěn)定性,這些證據(jù)表明核仁的應(yīng)激反應(yīng)是P53調(diào)控的充分必要條件。哺乳動(dòng)物的SIRT1蛋白是酵母SIR2基因產(chǎn)物的同源蛋白,是一類(lèi)NAD+細(xì)胞依賴(lài)的去乙酰化酶家族的成員之一。SIRT1通過(guò)參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng),起到調(diào)節(jié)糖脂代謝、細(xì)胞周期調(diào)控、對(duì)抗細(xì)胞衰老、抑制炎癥及氧化應(yīng)激損傷多方面的保護(hù)作用。研究發(fā)現(xiàn),SIRT1的亞細(xì)胞定位對(duì)SIRT1的細(xì)胞生物學(xué)作用有重大影響。SIRT1被認(rèn)為是核蛋白,雖然它也出現(xiàn)在胞質(zhì)中。最近,村上教授和同事們的研究表明,SIRT1通過(guò)作用于核仁的蛋白質(zhì)復(fù)合體(稱(chēng)為eNoSC-耗能式核仁的沉默復(fù)合體),感受細(xì)胞內(nèi)的能量狀態(tài)和控制核糖體RNA轉(zhuǎn)錄。該研究提示SIRT1還可能參與調(diào)節(jié)核仁的功能。盡管如此,SIRT1對(duì)核仁應(yīng)激反應(yīng)的作用和機(jī)制尚沒(méi)有研究。SIRT1的生物學(xué)作用由轉(zhuǎn)錄依賴(lài)和轉(zhuǎn)錄非依賴(lài)兩種途徑介導(dǎo)。廣泛的研究證明,腫瘤抑制基因P53是SIRT1眾多的靶蛋白的其中一員,在介導(dǎo)SIRT1的生物學(xué)作用上至關(guān)重要。SIRT1是P53的負(fù)調(diào)控因子,SIRT1可以在K382位點(diǎn)去乙�；疨53,而去乙�；疨53蛋白C端的關(guān)鍵賴(lài)氨酸殘基已經(jīng)被普遍認(rèn)為能夠抑制P53的功能。SIRT1對(duì)P53功能的抑制可能是其抗衰老和抗凋亡作用的一個(gè)主要機(jī)制。除了直接調(diào)節(jié)P53功能,SIRT1也影響P53蛋白的胞內(nèi)積累。例如,敲除SIRT1基因或用siRNA干擾SIRT1的表達(dá)可以使細(xì)胞P53蛋白含量增加。另外,microRNA-34a抑制SIRT1表達(dá)的效應(yīng)會(huì)導(dǎo)致乙�；疨53的積累。SIRT1調(diào)控P53蛋白積累的機(jī)制目前仍存在爭(zhēng)論。雖然初步證據(jù)表明SIRT1可能通過(guò)去乙�；疨53來(lái)增加P53泛素化的水平進(jìn)而加速其降解,但是有研究發(fā)現(xiàn)將P53去乙�；奈稽c(diǎn)全部突變之后,P53依然積累,這些體外和體內(nèi)的研究都不支持乙�；ヒ阴Ｗ饔迷赑53的穩(wěn)定性方面的重要作用。本研究的目包括以下兩方面：(1)明確核仁應(yīng)激反應(yīng)是否存在于血管細(xì)胞中,以及核仁應(yīng)激反應(yīng)是否對(duì)不同的刺激存在特異性；(2)探討SIRT1對(duì)細(xì)胞核仁應(yīng)激的作用和機(jī)制,明確SIRT1-核仁應(yīng)激途徑是否可以為SIRT1介導(dǎo)的不依賴(lài)乙酰化作用的P53穩(wěn)定性的調(diào)控機(jī)制提供一個(gè)合理的解釋。本論文包括以下五部分內(nèi)容：第一部分：血管細(xì)胞的核仁應(yīng)激反應(yīng)第二部分：SIRT1對(duì)細(xì)胞核仁應(yīng)激反應(yīng)的作用第三部分：SIRT1改善核仁應(yīng)激反應(yīng)的機(jī)制第四部分：SIRT1可能通過(guò)非去乙�；臋C(jī)制調(diào)節(jié)P53富集第五部分：心血管疾病中的核仁應(yīng)激現(xiàn)象第一部分：血管細(xì)胞中的核仁應(yīng)激反應(yīng)研究目的1.研究不同應(yīng)激刺激(ACTD, H2O2,熱休克,血清饑餓和氨基酸饑餓)對(duì)于Hela細(xì)胞核仁應(yīng)激的影響。2.研究在不同的應(yīng)激刺激下血管細(xì)胞(HUVEC, HSMC)能否發(fā)生核仁應(yīng)激。研究方法1.細(xì)胞培養(yǎng)：Hela細(xì)胞用高糖DMEM(含10%胎牛血清+1%青霉素/鏈霉素)貼壁培養(yǎng)。HUVEC為人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,用ECM(含10%胎牛血清+1%青霉素／鏈霉素+1%生長(zhǎng)因子)貼壁培養(yǎng)。HSMC為人平滑肌細(xì)胞,用高糖DMEM(含10%胎牛血清+1%青霉素/鏈霉素)貼壁培養(yǎng)。2.核仁應(yīng)激反應(yīng)檢測(cè)：用ACTD(5nM)刺激Hela細(xì)胞、HUVEC及HSMC 6.12,24小時(shí)；用H202刺激Hela細(xì)胞、HUVEC及HSMC,分別設(shè)計(jì)濃度梯度(0, 10μM,30μM,60μM, 100μM,300μM,600μM,1200μM)和時(shí)間梯度(0,2、4、8、12小時(shí)),以確定應(yīng)激反應(yīng)最佳濃度和時(shí)間。用無(wú)胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞制造血清饑餓模型,培養(yǎng)Hela細(xì)胞、HUVEC及HSMC 6、12、24小時(shí)；用HBSS代替培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞制造血清饑餓模型,培養(yǎng)Hela細(xì)胞、HUVEC及HSMC6、12、24小時(shí)；42℃,45℃培養(yǎng)細(xì)胞制造熱休克模型,培養(yǎng)Hela細(xì)胞、HUVEC及HSMC1、2、4小時(shí),對(duì)于以上處理的細(xì)胞應(yīng)用免疫熒光的方法檢測(cè)核仁特異性蛋白NPM和NS的變化,根據(jù)免疫熒光染色圖片計(jì)算細(xì)胞刺激后NPM核質(zhì)核仁熒光強(qiáng)度比和細(xì)胞完整核仁百分?jǐn)?shù)的變化,以此來(lái)評(píng)價(jià)核仁應(yīng)激的發(fā)生。分別用ACTD(5nM)和H2O2(Hela-600μM)刺激Hela細(xì)胞,收集細(xì)胞后,應(yīng)用RT-PCR的方法檢測(cè)核仁應(yīng)激相關(guān)因子pre-rRNA的水平,應(yīng)用Western blot方法檢測(cè)細(xì)胞P53表達(dá)的變化。3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,非配對(duì)t檢驗(yàn)或單因素方差分析(ANOVA)分別分析兩組和多組數(shù)據(jù),P0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究結(jié)果1.ACTD刺激能誘導(dǎo)Hela細(xì)胞、HUVEC及HSMC發(fā)生核仁應(yīng)激反應(yīng)。2.H2O2刺激能誘導(dǎo)Hela;細(xì)胞、HUVEC及HSMC發(fā)生核仁應(yīng)激反應(yīng)。3.血清饑餓不影響Hela細(xì)胞核仁形態(tài),血清饑餓可以誘導(dǎo)HUVEC和HSMC發(fā)生核仁應(yīng)激反應(yīng)。4.氨基酸饑餓能誘導(dǎo)Hela細(xì)胞、HUVEC及HSMC發(fā)生核仁應(yīng)激反應(yīng)。5.熱休克能誘導(dǎo)Hela細(xì)胞、HUVEC及HSMC發(fā)生核仁應(yīng)激反應(yīng)。6. ACTD和H202刺激都能降低Hela細(xì)胞pre-rRNA表達(dá)水平。7. ACTD刺激促進(jìn)Hela細(xì)胞P53蛋白的富集。研究結(jié)論1.在應(yīng)激刺激情況下血管細(xì)胞中(HUVEC, HSMC)的確存在核仁應(yīng)激的現(xiàn)象。2.雖然不同細(xì)胞發(fā)生核仁應(yīng)激的刺激條件可能存在差異,我們的結(jié)果支持核仁應(yīng)激是細(xì)胞應(yīng)激條件下的一個(gè)普遍反應(yīng),對(duì)不同刺激條件的特異性不明顯。第二部分：SIRT1對(duì)細(xì)胞核仁應(yīng)激反應(yīng)的作用研究目的明確SIRT1能否影響不同刺激引起的核仁應(yīng)激反應(yīng)研究方法1,為了闡明SIRT1能否干預(yù)核仁應(yīng)激的發(fā)生,本研究采用了四種方法改變Hela細(xì)胞SIRT1的水平：通過(guò)轉(zhuǎn)染SIRT1-Flag來(lái)過(guò)表達(dá)SIRT1(轉(zhuǎn)染pEGFP質(zhì)粒為對(duì)照)；通過(guò)轉(zhuǎn)染si-SIRT1來(lái)沉默SIRT1的表達(dá)(轉(zhuǎn)染si-nc為對(duì)照)；提取SIRT1-/-小鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(以小鼠平滑肌細(xì)胞系為對(duì)照)；應(yīng)用SIRT1激活劑Resveratrol(以Resveratrol的溶劑DMSO為對(duì)照)來(lái)增加細(xì)胞SIRT1蛋白的活性。干預(yù)SIRT1水平后,分別應(yīng)用ACTD和H202刺激細(xì)胞,免疫熒光方法檢測(cè)細(xì)胞核仁的變化。2,蛋白印跡實(shí)驗(yàn)Western blotting檢測(cè)：提取Hela細(xì)胞蛋白,檢測(cè)SIRT1蛋白表達(dá)水平。3,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,非配對(duì)t檢驗(yàn)或單因素方差分析(ANOVA)分別分析兩組和多組數(shù)據(jù),P0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究結(jié)果1,下調(diào)SIRT1的水平促進(jìn)核仁應(yīng)激的發(fā)生小干擾RNA下調(diào)SIRT1的表達(dá)后,Hela細(xì)胞的核仁并沒(méi)有發(fā)生應(yīng)激反應(yīng),但是分別加用H202和ACTD刺激后,在相同的刺激時(shí)間點(diǎn),與單純應(yīng)用藥物刺激組相比,NPM更早出現(xiàn)核質(zhì)轉(zhuǎn)位,核質(zhì)核仁熒光強(qiáng)度比更高,完整核仁百分比例更小,核仁應(yīng)激的發(fā)生更早。SIRT1-/-小鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的核仁結(jié)構(gòu)雖然沒(méi)有破壞,但是在基礎(chǔ)狀態(tài)下NPM的染色已經(jīng)出現(xiàn)在了核質(zhì)中,加用H202刺激后,與普通小鼠平滑肌細(xì)胞相比,核仁應(yīng)激發(fā)生更為嚴(yán)重。以上結(jié)果說(shuō)明下調(diào)SIRT1的水平促進(jìn)核仁應(yīng)激的發(fā)生。2,上調(diào)SIRT1的水平抑制核仁應(yīng)激的發(fā)生為進(jìn)一步驗(yàn)證SIRT1對(duì)核仁應(yīng)激的干預(yù)作用,我們通過(guò)轉(zhuǎn)染SIRT1-Flag質(zhì)粒來(lái)過(guò)表達(dá)野生型SIRT1,發(fā)現(xiàn)加用H202和ACTD刺激后,在相同的刺激時(shí)間,與單純應(yīng)用藥物刺激組相比,核仁應(yīng)激的發(fā)生更早,應(yīng)激程度更為嚴(yán)重,說(shuō)明上調(diào)SIRT1的水平抑制核仁應(yīng)激的發(fā)生。研究結(jié)論SIRT1是核仁應(yīng)激的負(fù)調(diào)控因子,抑制細(xì)胞核仁應(yīng)激的發(fā)生。第三部分：SIRT1改善核仁應(yīng)激反應(yīng)的機(jī)制研究目的：1,探討SIRT1調(diào)節(jié)核仁應(yīng)激的生物學(xué)機(jī)制2,研究SIRT1與核仁之間的關(guān)系,SIRT1與核仁蛋白NPM是否共定位3,研究SIRT1是否去乙�；疦PM,探討SIRT1與核仁蛋白NPM的關(guān)系。研究方法：1,細(xì)胞核仁的分離與鑒定：SIRT1抑制劑EX-527處理24小時(shí)的Hela細(xì)胞經(jīng)低滲裂解分離細(xì)胞核,相差顯微鏡觀察下,密度梯度離心分離細(xì)胞核仁,western blot檢測(cè)核仁marker-NPM, NS, Fibrillarin;核質(zhì)marker-Histone H3;細(xì)胞質(zhì)marker-GAPDH,以驗(yàn)證提取核仁的純度。2, SILAC-蛋白組學(xué)分析：一組Hela細(xì)胞用含有15N標(biāo)記的精氨酸的SILAC DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)6代,另一組Hela細(xì)胞用一般DMEN培養(yǎng),轉(zhuǎn)染SIRT1-Flag質(zhì)粒,兩組按等細(xì)胞數(shù)混合,提取蛋白后,應(yīng)用抗Flag的抗體進(jìn)行免疫沉淀純化,最后質(zhì)譜鑒定,以篩選出Hela細(xì)胞中所有與SIRT1相結(jié)合的蛋白。3,免疫共沉淀：Hela細(xì)胞轉(zhuǎn)染SIRT1-Flag質(zhì)粒,提取蛋白,免疫共沉淀法檢測(cè)外源性的SIRT1與NPM是否結(jié)合。Hela細(xì)胞轉(zhuǎn)染pEGFP質(zhì)粒(對(duì)照),H363Y質(zhì)粒(無(wú)活性SIRT1)和SIRT1質(zhì)粒(野生型),加用ACTD刺激24小時(shí)后提取蛋白,免疫共沉淀法檢測(cè)NPM的乙�；欠窀淖儭ela細(xì)胞提取蛋白,免疫共沉淀法檢測(cè)內(nèi)源性NPM與SIRT1是否結(jié)合4, Western Blot:Hela細(xì)胞轉(zhuǎn)染pEGFP質(zhì)粒(對(duì)照),H363Y質(zhì)粒(無(wú)活性SIRT1)和SIRT1質(zhì)粒(野生型),加用ACTD刺激24小時(shí)后提取蛋白,檢測(cè)NPM,標(biāo)簽Flag, AC-lysine, β-Actin蛋白表達(dá)。Hela細(xì)胞EX-527處理24小時(shí)后,后提取蛋白,檢測(cè)NPM, AC-lysine, β-Actin蛋白表達(dá)。5,免疫熒光法觀察SIRT1在Hela細(xì)胞中的分布,檢測(cè)SIRT1與核仁蛋白NPM是否共定位。6,為了研究SIRT1抑制核仁應(yīng)激的作用是否依賴(lài)于它去乙�；傅幕钚�,本研究采用了三種方法改變SIRT1的活性：應(yīng)用SIRT1激活劑Resveratrol(以Resveratrol的溶劑DMSO為對(duì)照)預(yù)處理2小時(shí),來(lái)增加SIRT1的活性；應(yīng)用SIRT1抑制劑EX-527(以EX-527的溶劑DMSO為對(duì)照)預(yù)處理2小時(shí),來(lái)抑制SIRT1的活性；轉(zhuǎn)染無(wú)SIRT1活性的質(zhì)粒H363Y來(lái)過(guò)表達(dá)沒(méi)有活性的SIRT1(以轉(zhuǎn)染pEGFP質(zhì)粒為對(duì)照),然后用ACTD刺激細(xì)胞,免疫熒光方法檢測(cè)細(xì)胞核仁的變化。7, NPM-pGEX質(zhì)粒構(gòu)建和轉(zhuǎn)化：采用pGEX-4T-1質(zhì)粒作為載體質(zhì)粒,以NPM-GFP中NPM段作為目的片段,根據(jù)合適位點(diǎn)選取BamHI酶切,連接目的基因和載體質(zhì)粒后,通過(guò)基因測(cè)序的方法驗(yàn)證NPM-pGEX質(zhì)粒構(gòu)建成功,然后將合成的NPM-pGEX質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入BL21感受態(tài)細(xì)菌。8, NPM-GST融合蛋白的大量表達(dá)和純化：菌種種板,挑菌,搖菌4h,加融合蛋白誘導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)1h,提取NPM-GST融合蛋白,加入resin-bead純化蛋白,然后行SDS-PAGE電泳分離,考馬斯亮藍(lán)染色驗(yàn)證。9,體外乙�；腿ヒ阴；瘜�(shí)驗(yàn)：純化的NPM-GST融合蛋白,加用CBP和乙酰輔酶A,在乙�；磻�(yīng)混合液將NPM充分乙酰化,然后再加入SIRT1和NAD+,在去乙�；磻�(yīng)液中孵育,收取純化的NPM-GST融合蛋白,經(jīng)過(guò)CBP處理的蛋白和經(jīng)過(guò)CBP處理后又用SIRT1處理的蛋白,質(zhì)譜分析結(jié)果。10, SIRT1 truncate實(shí)驗(yàn)：從GeneBank找到SIRT1-Flag質(zhì)粒的序列,應(yīng)用Overlap extension PCR的方法,分別truncate掉SIRT1的C端、N端和中間區(qū)域,得到三個(gè)帶Flag標(biāo)簽的重組質(zhì)粒(分別標(biāo)為519、104、265),將它們和原始質(zhì)粒SIRT1-Flag轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞,48小時(shí)后收取細(xì)胞：(1)進(jìn)行免疫沉淀實(shí)驗(yàn),已檢測(cè)SIRT1分子與NPM結(jié)合的具體部位；(2)加用ACTD (5nM)處理24小時(shí),進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn),檢測(cè)truncate后的SIRT1是否還能保護(hù)核仁。11,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,非配對(duì)t檢驗(yàn)或單因素方差分析(ANOVA)分別分析兩組和多組數(shù)據(jù),P0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究結(jié)果：1, SIRT1與核仁標(biāo)記性蛋白NPM相結(jié)合。為研究SIRT1與核仁之間的關(guān)系,我們應(yīng)用SILAC的方法,細(xì)胞蛋白質(zhì)被含有15N標(biāo)記精氨酸所標(biāo)記,經(jīng)免疫沉淀加質(zhì)譜分析篩選出了Hela細(xì)胞中所有與SIRT1相結(jié)合的蛋白,其中就包括NPM。免疫共沉淀和WB檢測(cè)顯示外源轉(zhuǎn)入的SIRT1可與NPM結(jié)合,細(xì)胞內(nèi)源的NPM也可以與SIRT1結(jié)合。免疫熒光結(jié)果顯示SIRT1與NPM的染色共定位。2, SIRT1在提取的Hela細(xì)胞核仁中部分表達(dá)。用Hela細(xì)胞提取到的核仁在相差顯微鏡下呈現(xiàn)為大小基本一致、形態(tài)較為規(guī)則的雙折射的小點(diǎn)。為鑒定核仁的純度,對(duì)提取的核仁蛋白和核質(zhì)蛋白WB檢測(cè)顯示,Fibrillarin和NS在核仁蛋白中富集,Histone H3在核質(zhì)蛋白富集,核仁蛋白幾乎沒(méi)有,說(shuō)明提取的核仁沒(méi)有核質(zhì)的污染,GAPDH在核仁蛋白幾乎沒(méi)有,說(shuō)明提取的核仁沒(méi)有細(xì)胞質(zhì)的污染。SIRT1主要分布在核質(zhì)中,在核仁也有部分表達(dá)。3, SIRT1 truncate實(shí)驗(yàn)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),truncate過(guò)后,SIRT1104仍與NPM結(jié)合,SIRT1519仍與NPM結(jié)合,而SIRT1265不與NPM結(jié)合,說(shuō)明只有SIRT1中間區(qū)域決定其與NPM相結(jié)合的功能。加用ACTD刺激后,而不與NPM結(jié)合的SIRT 1265失去了保護(hù)核仁抵抗應(yīng)激的功能。4, SIRT1抑制核仁應(yīng)激的作用只部分依賴(lài)于它去乙�；傅幕钚�。我們發(fā)現(xiàn),Hela細(xì)胞過(guò)表達(dá)沒(méi)有活性的SIRT1和有酶活性的SIRT1,發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比,兩者都可以顯著降低ACTD刺激后Hela細(xì)胞NPM的核質(zhì)核仁熒光強(qiáng)度比,明顯增加完整核仁的百分比例。說(shuō)明SIRT1酶的活性在改善核仁應(yīng)激的反應(yīng)中并非具有唯一決定性的作用。過(guò)表達(dá)沒(méi)有活性的SIRT1和有酶活性的SIRT1兩組間相比,有酶活性的SIRT1組完整核仁的百分比例更高,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,以上實(shí)驗(yàn)說(shuō)明SIRT1酶活性在其參與改善核仁應(yīng)激的過(guò)程中起部分作用。為徹底失活SIRTI,我們先用SIRT1抑制劑EX-527預(yù)處理細(xì)胞后,再過(guò)表達(dá)無(wú)酶活性的SIRT1和有酶活性的SIRT1,發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比,兩組結(jié)果類(lèi)似,都能引起NPM免疫熒光染色的P/L明顯降低,完整核仁的百分比例顯著增加,兩組間沒(méi)有差異,說(shuō)明SIRT1抑制核仁應(yīng)激的作用只是部分依賴(lài)于它去乙�；傅幕钚�。5, SIRT1沒(méi)有顯著影響Hela細(xì)胞的NPM乙酰化。過(guò)表達(dá)野生型SIRT1和無(wú)活性的SIRT1后,提取細(xì)胞總蛋白,用抗Ac-lysine的抗體進(jìn)行Western blot檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比,細(xì)胞總蛋白乙�；皆谶^(guò)表達(dá)野生型SIRT1后下降,在過(guò)表達(dá)無(wú)活性SIRT1后升高,說(shuō)明這兩個(gè)質(zhì)粒代表的SIRT1活性正確。應(yīng)用SIRT1抑制劑EX-527處理Hela細(xì)胞24小時(shí)后,提取細(xì)胞核仁,用抗Ac-lysine的抗體進(jìn)行Western blot檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比,細(xì)胞總蛋白,細(xì)胞質(zhì)蛋白和核質(zhì)蛋白的乙�；皆黾�,核仁蛋白的乙�；揭灿兴淖�,說(shuō)明此抑制劑EX-527和抗Ac-lysine抗體的特異性沒(méi)有問(wèn)題,而且SIRT1酶參與改變核仁蛋白的乙酰化。為進(jìn)一步研究SIRT1能否去乙酰化NPM,在過(guò)表達(dá)野生型SIRT1和無(wú)活性的SIRT1后,收取蛋白,應(yīng)用抗NPM的抗體進(jìn)行免疫沉淀(IP),富集之后將所得到的蛋白進(jìn)行Western blot檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比,Hela細(xì)胞乙�；腘PM表達(dá)沒(méi)有顯著改變。既往的研究發(fā)現(xiàn),NPM的C端有8個(gè)位點(diǎn)的賴(lài)氨酸可以被乙�；�。所以我們通過(guò)體外乙�；腿ヒ阴；瘜�(shí)驗(yàn),研究在體外系統(tǒng)NPM是否能被乙酞化酶CBP乙酰化進(jìn)而被去乙�；窼IRTI去乙酰化。質(zhì)譜分析的結(jié)果顯示,NPM在乙�；窩BP和乙酰輔酶A (Ac-CoA)都存在的條件下,可以被CBP乙�；．�(dāng)有SIRT1和輔酶NAD+都存在的條件下,NPM C端乙�；馁�(lài)氨酸只有一個(gè)位點(diǎn)可以被去乙酞化。綜合以上結(jié)果我們推測(cè)SIRT1介導(dǎo)的NPM去乙�；谝种坪巳蕬�(yīng)激反應(yīng)的作用中可能不起決定性作用。6, SIRT1能上調(diào)NPM蛋白水平。Western blot結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,過(guò)表達(dá)野生型的SIRT1和無(wú)活性的SIRT1都能上調(diào)Hela細(xì)胞基礎(chǔ)水平和ACTD刺激后的NPM蛋白表達(dá),兩組間結(jié)果比較,野生型的SIRT1作用更強(qiáng)。應(yīng)用SIRT1活性的抑制劑EX-527后,NPM蛋白水平明顯下降。由此可見(jiàn),SIRT1去乙�；傅幕钚砸约八谋磉_(dá)量都參與上調(diào)NPM蛋白水平。研究結(jié)論1, SIRT1在Hela細(xì)胞核仁中表達(dá),與核仁蛋白NPM相結(jié)合2,與NPM結(jié)合的是SIRT1蛋白中間段,不與NPM結(jié)合后,SIRT1喪失了對(duì)核仁的保護(hù)作用。3, SIRT1抑制Hela細(xì)胞核仁應(yīng)激只部分依賴(lài)于其去乙�；傅淖饔谩�4, SIRT1介導(dǎo)的NPM去乙�；谝种坪巳蕬�(yīng)激反應(yīng)中可能不起決定性作用。第四部分：SIRT1可能通過(guò)非去乙�；臋C(jī)制調(diào)節(jié)P53富集研究目的：1,研究SIRT1對(duì)核仁應(yīng)激發(fā)生時(shí)P53表達(dá)的影響。2,探討SIRT1影響細(xì)胞P53富集的機(jī)制。研究方法：1,免疫熒光法檢測(cè)P53表達(dá)：PBS清洗細(xì)胞,冰甲醇4℃固定,1%BSA封閉,一抗(1%BSA配置)4℃孵育過(guò)夜,二抗(1%BSA配置)避光常溫孵育1小時(shí),DAPI細(xì)胞核染色,抗熒光淬滅分片劑封片。2, Western blot法檢測(cè)P53表達(dá)：胰酶消化收取細(xì)胞后,裂解液裂解細(xì)胞提取蛋白,SDS-PAGE電泳分離蛋白樣品,轉(zhuǎn)移蛋白到PVDF膜上,封閉后一抗4℃過(guò)夜,然后二抗常溫孵育2小時(shí)。ECL化學(xué)發(fā)光顯影目的蛋白條帶,LAS-4000化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè),Image J軟件進(jìn)行條帶分析。3,構(gòu)建P53突變質(zhì)粒：從Gene Bank中找到人野生型P53蛋白的氨基酸序列,然后根據(jù)文獻(xiàn)找到P53蛋白中所有能夠去乙�；奈稽c(diǎn)共有8個(gè),分別是K120、 K164、K370、K372、K373、K381、K382、K386,將這8個(gè)位點(diǎn)的精氨酸全部突變成賴(lài)氨酸,使之失去被乙酰化的能力,突變前后P53蛋白的密碼子序列見(jiàn)附表,將這樣的蛋白做成含有GFP標(biāo)簽的質(zhì)粒P53 mutant (8KR).4,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,非配對(duì)t檢驗(yàn)或單因素方差分析(ANOVA)分別分析兩組和多組數(shù)據(jù),P0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義研究結(jié)果：1, Hela細(xì)胞核仁應(yīng)激的發(fā)生早于P53的積累。用ACTD刺激Hela細(xì)胞,設(shè)計(jì)時(shí)間曲線(xiàn)0,2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24小時(shí),核仁應(yīng)激最早發(fā)生在4小時(shí),而Western blot顯示P53積累大約發(fā)生在22小時(shí)。2, SIRT1抑制核仁應(yīng)激引起的P53富集。免疫熒光和WB方法發(fā)現(xiàn),ACTD刺激Hela細(xì)胞能引起P53蛋白水平增加,過(guò)表達(dá)SIRT1能明顯降低P53的富集。3, SIRT1能通過(guò)不依賴(lài)于去乙酰化作用調(diào)節(jié)P53富集。免疫熒光和WB方法發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,在ACTD刺激后,過(guò)表達(dá)野生型SIRT1和沒(méi)有活性的SIRT1都能明顯降低P53的富集,兩組間比較發(fā)現(xiàn),過(guò)表達(dá)野生型SIRT1下調(diào)P53的作用更強(qiáng)烈。先用SIRT1抑制劑EX-527預(yù)處理細(xì)胞再過(guò)表達(dá)無(wú)酶活性的SIRT1,可以徹底滅活SIRT1,我們發(fā)現(xiàn)這樣的SIRT1依然能明顯降低P53的富集,由此可見(jiàn),SIRT1抑制P53富集的作用不完全依賴(lài)于SIRT1去乙�；傅幕钚浴ela細(xì)胞轉(zhuǎn)染突變得到的P53 mutant (8KR)-GFP質(zhì)粒,這樣轉(zhuǎn)入細(xì)胞的P53不能被去乙�；�,因此不受SIRT1活性的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)在此基礎(chǔ)上過(guò)表達(dá)野生型SIRT1和無(wú)活性的SIRT1能降低外源P53表達(dá)水平,這樣進(jìn)一步證實(shí)了SIRT1可以不依賴(lài)于去乙�；饔谜{(diào)節(jié)P53的水平。研究結(jié)論：SIRT1抑制核仁應(yīng)激引起的P53富集,這個(gè)過(guò)程可能不依賴(lài)于SIRT1去乙酰化作用。第五部分：心血管疾病中的核仁應(yīng)激現(xiàn)象研究目的：探討在心血管疾病的動(dòng)物模型上是否存在核仁應(yīng)激現(xiàn)象。研究方法：1,心肌肥厚動(dòng)物模型：8周齡雄性C57BL/6小鼠購(gòu)自北京維通利華公司。12周齡的雄性小鼠被選擇進(jìn)入實(shí)驗(yàn)研究,隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組、TAC-2周組、TAC-4周組。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合山東大學(xué)齊魯醫(yī)院倫理委員會(huì)對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的要求和規(guī)定。通過(guò)對(duì)小鼠進(jìn)行主動(dòng)脈縮窄術(shù)建立心肌肥厚模型。2,心肌肥厚動(dòng)物超聲心動(dòng)圖檢測(cè)：建立小鼠TAC動(dòng)物模型前1天及術(shù)后4周進(jìn)行心臟超聲檢測(cè),測(cè)量左室舒張末期內(nèi)徑、左室收縮末期內(nèi)徑、室間隔厚度、左室后壁厚度,并計(jì)算左室射血分?jǐn)?shù)、左室短軸縮短率、左室重量。3,組織免疫熒光檢測(cè)：留取實(shí)驗(yàn)小鼠心臟標(biāo)本,制作石蠟切片,組織免疫熒光染色檢測(cè)心肌NPM表達(dá)和定位情況,計(jì)算心肌細(xì)胞NPM核質(zhì)核仁熒光強(qiáng)度比和細(xì)胞完整核仁百分?jǐn)?shù)。4,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：計(jì)量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩組之間比較采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)；多組之間比較采用one-way ANOVA檢驗(yàn)及q檢驗(yàn)。若P0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究結(jié)果：心肌肥厚失代償期的小鼠心肌細(xì)胞發(fā)生核仁應(yīng)激。壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)心肌重構(gòu)的發(fā)生和發(fā)展。依據(jù)心臟超聲檢測(cè)結(jié)果,TAC術(shù)后2周發(fā)生代償性心肌肥厚,術(shù)后4周發(fā)生失代償性心肌肥厚、心力衰竭。NPM免疫熒光結(jié)果顯示,TAC-2周組心肌細(xì)胞核仁結(jié)構(gòu)尚完整,NPM核質(zhì)核仁熒光強(qiáng)度比略有增加,而TAC-4周組心肌細(xì)胞核仁結(jié)構(gòu)瓦解,NPM從核仁轉(zhuǎn)位到核質(zhì),發(fā)生了核仁應(yīng)激。研究結(jié)論：心肌肥厚失代償期的小鼠心肌發(fā)生核仁應(yīng)激。背景血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)于維持血管正常的結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)態(tài)具有舉足輕重的作用。內(nèi)皮細(xì)胞正常的生物學(xué)功能對(duì)血液流動(dòng)造成的剪切應(yīng)力的刺激具有高度的敏感性。剪切力作用于內(nèi)皮細(xì)胞的表面,被認(rèn)為是最重要的血管活性因素之一。大量的研究證據(jù)表明,層流狀態(tài)的血流及一定強(qiáng)度的穩(wěn)定的剪切力(生理狀況的剪切力)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞具有保護(hù)作用,而非正常的剪切力(過(guò)低或者震蕩型剪切力),即病理狀況的剪切力,對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞具有破壞作用,引起內(nèi)皮功能異常和多種血管疾病。機(jī)械應(yīng)力刺激引起的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程涉及多種細(xì)胞內(nèi)的信使分子和信號(hào)傳導(dǎo)蛋白,它們選擇性的調(diào)節(jié)很多重要的內(nèi)皮功能,比如基因表達(dá),增殖,遷移,形態(tài)發(fā)生,通透性,炎癥反應(yīng),血栓形成及毛細(xì)血管新生等重要生理功能。自噬是進(jìn)化過(guò)程中高度保守的一種細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)。自噬一種細(xì)胞自我消化的過(guò)程,負(fù)責(zé)完成對(duì)未折疊蛋白和受損傷的細(xì)胞器的清除降解。自噬過(guò)程主要依賴(lài)于自噬小體的形成,自噬小體是具有雙層膜的囊泡結(jié)構(gòu),包裹運(yùn)送受損的細(xì)胞組分。自噬過(guò)程需要一系列自噬相關(guān)蛋白的表達(dá),氣質(zhì)關(guān)鍵的一些分子包括LC3A, beclin-1, Atg5, Atg7和Atg12等。自噬小體形成后,與溶酶體融合形成自噬溶酶體,通過(guò)各種水解酶的作用在酸性環(huán)境下將細(xì)胞組分消化降解。經(jīng)典的自噬誘導(dǎo)因素是細(xì)胞代謝應(yīng)激(例如氨基酸饑餓),在這種情況下,Akt-mTOR通路受到抑制,從而啟動(dòng)自噬反應(yīng),因此mTOR通路在自噬反應(yīng)中具有中心作用。在內(nèi)皮細(xì)胞中,自噬反應(yīng)可以被多種應(yīng)激因素誘導(dǎo)。根據(jù)應(yīng)激刺激的形式,強(qiáng)度以及細(xì)胞所處的環(huán)境不同,自噬引起的結(jié)局可能不同,細(xì)胞存活或死亡。另外,有證據(jù)顯示內(nèi)皮細(xì)胞的自噬過(guò)程還參與調(diào)解其他重要的功能,包括細(xì)胞的衰老和毛細(xì)血管新生能力。因此,了解內(nèi)皮細(xì)胞中自噬調(diào)節(jié)過(guò)程的分子機(jī)制,對(duì)于在應(yīng)激狀態(tài)下如何保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)穩(wěn)態(tài)具有重要的科學(xué)意義。然而,目前對(duì)于剪切力和內(nèi)皮細(xì)胞自噬功能之間的關(guān)系還沒(méi)有任何研究報(bào)道。哺乳動(dòng)物的SIRT1蛋白是酵母SIR2基因產(chǎn)物的同源蛋白,是一類(lèi)NAD+細(xì)胞依賴(lài)的去乙�；讣易宓某蓡T之一。SIRT1在調(diào)節(jié)細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)中扮演重要角色。在內(nèi)皮細(xì)胞中,許多研究證據(jù)表明SIRT1在維持細(xì)胞正常功能當(dāng)中具有多方面的保護(hù)作用。例如SIRT1能和內(nèi)皮一氧化氮合酶結(jié)合,使其去乙�；⒃黾右谎趸尼尫拧Ａ硗�,激活的SIRT1還能介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的抗炎癥作用并對(duì)抗細(xì)胞衰老。有證據(jù)顯示SIRT1可以調(diào)節(jié)自噬。綜上所述,目前一個(gè)未知的科學(xué)問(wèn)題是剪切力可能通過(guò)調(diào)節(jié)SIRT1來(lái)影響內(nèi)皮細(xì)胞自噬反應(yīng)。目的1,研究剪切力對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞自噬反應(yīng)的影響。2,探討SIRT1在介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞自噬反應(yīng)中的作用及生物學(xué)機(jī)制。方法1,體外剪切力模型構(gòu)建：人臍胙脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)種在鋪有膠原的載玻片上,分為Flow組(剪切力組)和Static組(無(wú)剪切力組),模擬Frangos等設(shè)計(jì)的細(xì)胞層流裝置,采用M199培養(yǎng)基作為流體,用剪切力(20 dyne/cm2)作用于HUVEC細(xì)胞制造層流剪切力模型,用剪切力(4 dyne/cm2)作用于HUVEC細(xì)胞制造低剪切力模型,用剪切力(振蕩流±5 dyn/cm2 1 Hz)作用于HUVEC細(xì)胞制造震蕩剪切力模型。2,檢測(cè)自噬功能應(yīng)用下列方法：(1)免疫熒光方法檢測(cè)細(xì)胞LC3的定位,計(jì)數(shù)LC3的點(diǎn)狀聚集,以L(fǎng)C3的點(diǎn)狀聚集陽(yáng)性細(xì)胞占總細(xì)胞的百分比來(lái)評(píng)價(jià)自噬發(fā)生的嚴(yán)重程度。(2) RT-PCR檢測(cè)自噬相關(guān)基因P62的表達(dá)。(3)WB檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3、P62、ATG5、ATG7、FoxO1、mTOR的蛋白表達(dá)。3,免疫共沉淀法檢測(cè)層流處理后自噬相關(guān)蛋白ATG5、ATG7、FoxO的乙�；健�4,應(yīng)用Amplex red熒光法檢測(cè)NADPH氧化酶抑制劑對(duì)層流處理后HUVEC ROS水平的影響。5,應(yīng)用Caspase 3/7試劑盒檢測(cè)在層流剪切力干預(yù),或者應(yīng)用各種自噬抑制劑時(shí)下HUVEC的凋亡情況。6,構(gòu)建帶有SIRT1熒光素酶報(bào)告基因的質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染HUVEC細(xì)胞,用熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)層流后SIRT1基因啟動(dòng)子的活性。結(jié)果1,免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)生理狀況下的層流剪切力誘導(dǎo)促進(jìn)自噬,而低剪切力和振蕩剪切力不促進(jìn)自噬。2,時(shí)程分析和層流停止實(shí)驗(yàn)證實(shí),層流剪切力引起的自噬反應(yīng)并不是一個(gè)短暫的適應(yīng)壓力反應(yīng),而是一個(gè)持續(xù)的生理作用。3,氨基酸饑餓引起HUVEC自噬反應(yīng)的發(fā)生,類(lèi)似層流剪切力引起的自噬,可以用作陽(yáng)性對(duì)照。4,層流剪切力增加P62的轉(zhuǎn)錄,但沒(méi)有改變P62的蛋白水平。5,自噬抑制劑氯喹顯著增加HUVEC LC3的含量。6,自噬后期的抑制劑Bafilomycin A1既能增加基礎(chǔ)狀況下HUVEC LC3的含量,又能增加層流剪切力后HUVEC LC3的含量。7,層流剪切力不改變HUVEC mTOR的磷酸化水平。8,層流剪切力增強(qiáng)HUVEC基因啟動(dòng)子的活性。9, SIRT1去乙�；傅幕钚栽谄湔{(diào)節(jié)細(xì)胞自噬的過(guò)程中起重要作用。10,層流剪切力內(nèi)皮細(xì)胞自噬反應(yīng)的調(diào)節(jié)是氧化還原依賴(lài)的。層流剪切力顯著增加活性氧的產(chǎn)生,這個(gè)作用可以被NADPH氧化酶抑制劑阻斷�；钚匝醯那宄齽〦UK-134和抗氧化劑NAC阻斷層流剪切力對(duì)SIRT1和LC3蛋白表達(dá)的上調(diào)。11, SIRT1依賴(lài)的FoxO1激活在層流剪切力介導(dǎo)的自噬調(diào)節(jié)中是至關(guān)重要的。層流剪切力降低FoxO1乙�；�,過(guò)表達(dá)持續(xù)活化的FoxO1能明顯增加HUVECLC3的含量。12,層流剪切力降低自噬相關(guān)蛋白ATG5和ATG7的乙�；�。13,自噬反應(yīng)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞有保護(hù)作用。自噬抑制劑3-MA加重血清饑餓引起的HUVEC細(xì)胞凋亡,3-MA阻斷層流剪切力介導(dǎo)的自噬發(fā)生。轉(zhuǎn)染小干擾RNA沉默ATG5表達(dá)部分減弱了白藜蘆醇在血清饑餓引起的細(xì)胞凋亡的細(xì)胞保護(hù)作用,ATG5基因沉默也部分扭轉(zhuǎn)應(yīng)用細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑時(shí)層流剪切力發(fā)揮的細(xì)胞保護(hù)作用。結(jié)論：層流剪切力通過(guò)氧化還原反應(yīng)和依賴(lài)SIRT1的機(jī)制促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞自噬。內(nèi)皮細(xì)胞中剪切力誘導(dǎo)的自噬可能是層流血液流動(dòng)保護(hù)血管作用的一種新機(jī)制。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R54
【圖文】：

圖１，免疫巧光方法檢測(cè)用ＡＣＴＤ刺激Ｈｅｌａ細(xì)胞后ＮＰＭ的細(xì)胞定位

疫巧光方法檢測(cè)用ＡＣＴＤ刺激Ｈｅｌａ細(xì)胞后ＮＰＭ的細(xì)胞定位。Ｄ邋（５ｎＭ）分別刺激Ｈｅｌａ細(xì)胞Ｏｈ、６ｈ、１２ｈ、２４ｈ，應(yīng)用ＡＣＴＤ為對(duì)照，用ＤＡＰＩ進(jìn)行細(xì)胞核染色，Ｍｅｒｇｅ：邋ＮＰＭ和細(xì)胞核的圖

免疫巧光方法檢測(cè)用ＡＣＴＤ刺激ＨＵＶＥＣ細(xì)胞后ＮＰＭ的細(xì)胞定位。加刺激ＡＣＴＤ邋（５ｎＭ）分別刺激ＨＵＶＥＣ細(xì)胞Ｏｈ、６ｈ、１２ｈ、２仙。應(yīng)用ＡＣＴＤ溶劑ＤＭＳＯ作為對(duì)照，用ＤＡＰＩ進(jìn)行細(xì)胞核染色，Ｍｅｒｇｅ：邋ＮＰＭ和細(xì)胞核的像融合。逡逑ＮＰＭ邐ＤＡＰＩ邐Ｍｅｒｇｅ逡逑ＡＣＴＤ－６ｈ逡逑ＡＣＴＤ－１２ｈ逡逑

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 ;Altered subcellular distribution of nucleolar protein fibrillarin by actinomycin D in HEp-2 cells[J];Acta Pharmacologica Sinica;2004年07期

本文編號(hào)：2754560