【摘要】：目的心力衰竭(heart failure,HF)是多種心臟疾病發(fā)展到終末階段的臨床癥候群,主要表現(xiàn)為心肌收縮功能的降低,嚴(yán)重威脅人類的身體健康。中國(guó)作為世界上擁有最大心衰患者群的國(guó)家之一,研究心衰的發(fā)病機(jī)制并改善衰竭心臟的心功能,提高心衰患者的生存質(zhì)量是目前亟待解決的問(wèn)題。心衰的機(jī)制在細(xì)胞水平上主要涉及心肌細(xì)胞損傷,心肌細(xì)胞屬于終末期細(xì)胞,其損傷對(duì)于心臟的形態(tài)結(jié)構(gòu)具有不可逆性改變。因此,本課題旨在通過(guò)阿霉素復(fù)制心肌細(xì)胞損傷模型,在細(xì)胞水平上探討Liguzinediol對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及機(jī)理。方法1.Liguzinediol對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞損傷的影響利用MTT檢測(cè)不同濃度Liguzinediol作用于H9C2細(xì)胞24和48小時(shí),確定Liguzinediol對(duì)正常心肌細(xì)胞是否有毒性;然后將不同濃度阿霉素作用于H9C2細(xì)胞24小時(shí),確定阿霉素?fù)p傷心肌細(xì)胞50%的濃度;在此基礎(chǔ)上篩選Liguzinediol對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞損傷有保護(hù)作用的高、中、低三個(gè)濃度。然后將H9C2細(xì)胞分為:空白對(duì)照組、阿霉素組、Liguzinediol高、中、低劑量組,觀察Liguzinediol對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞損傷的保護(hù)作用;膠原收縮實(shí)驗(yàn)觀察Liguzinediol對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的受損的H9C2細(xì)胞收縮功能的影響。2.Liguzinediol對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞凋亡的影響利用Hochest33258染色以及流式細(xì)胞術(shù)FITC/PI染色觀察Liguzinediol對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞凋亡的影響;Western blot觀察Liguzinediol對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Pro-caspase-3、Cleaved-caspase-3、Bax、Bcl-2以及細(xì)胞色素C(CytC)表達(dá)的影響。3.圍繞鈣穩(wěn)態(tài)探討Liguzinediol抑制阿霉素誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞凋亡的機(jī)理首先利用鈣成像技術(shù)觀察Liguzinediol在有鈣緩沖液和無(wú)鈣緩沖液中對(duì)大鼠原代心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響;再通過(guò)灌流阿霉素動(dòng)態(tài)觀察其對(duì)心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響,進(jìn)而觀察Liguzinediol對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失衡的調(diào)控;Western blot和PCR分別觀察Liguzinediol對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)和線粒體內(nèi)鈣相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體及其信號(hào)通路的影響。結(jié)果1 Liguzinediol能夠減少阿霉素誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞損傷MTT結(jié)果表明,與空白對(duì)照組比較,Liguzinediol的濃度低于10-1mol/L濃度時(shí)對(duì)H9C2細(xì)胞無(wú)毒性,說(shuō)明Liguzinediol的濃度在低于10-1mol/L屬于安全范圍,可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。阿霉素復(fù)制H9C2細(xì)胞損傷模型的結(jié)果表明,阿霉素濃度為5μmol/L時(shí),其損傷率達(dá)50%左右,因此選擇此濃度作為后續(xù)試驗(yàn)的造模濃度。與空白對(duì)照組比較,阿霉素組H9C2細(xì)胞的吸光度(OD值)明顯降低,具有顯著性差異;在此基礎(chǔ)上給予不同濃度的Liguzinediol,結(jié)果與阿霉素組比較,Liguzinediol(10-4、10-5、1 0-6mol/L)能夠明顯增加H9C2細(xì)胞活力并呈劑量依賴性,說(shuō)明Liguzinediol能夠減輕阿霉素誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞損傷。膠原收縮實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與空白對(duì)照組比較,阿霉素組H9C2細(xì)胞收縮功能明顯降低,膠原面積增加,收縮減少;與阿霉素組比較,Liguzinediol能夠明顯改善阿霉素誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞收縮功能的降低引起膠原收縮面積減少,收縮增加,說(shuō)明Liguzinediol能夠增強(qiáng)阿霉素誘導(dǎo)的受損H9C2細(xì)胞的收縮功能。2 Liguzinediol可明顯抑制阿霉素誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞凋亡Hochest33258染色結(jié)果顯示阿霉素組出現(xiàn)H9C2細(xì)胞染色質(zhì)固縮、細(xì)胞質(zhì)亮染以及細(xì)胞核碎裂等凋亡的典型特征,給予Liguzinediol后能夠明顯減少凋亡的發(fā)生;流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn),與空白對(duì)照組比較,阿霉素組H9C2細(xì)胞的凋亡率顯著增加,給予Liguzinediol后凋亡率明顯降低;Western blot檢測(cè)結(jié)果表明,與空白對(duì)照組比較,阿霉素組凋亡相關(guān)蛋白Cleaved-caspase-3以及細(xì)胞色素C(CytC)的表達(dá)增加而pro-Caspase-3蛋白表達(dá)減少,給予Liguzinediol后,與阿霉素組比較pro-Caspase-3蛋白表達(dá)增加而Cleaved-caspase-3以及CytC的蛋白表達(dá)減少。另外,與空白對(duì)照組比較,阿霉素組Bax的蛋白表達(dá)顯著增加而B(niǎo)cl-2的蛋白表達(dá)減少,使Bax/Bcl-2的比例增加,給予Liguzinediol后,與阿霉素組比較Bcl-2表達(dá)明顯增加引起B(yǎng)ax/Bcl-2的比例相對(duì)減少,說(shuō)明Liguzinediol能夠通過(guò)抑制Cleave-Caspase-3、Bax和CytC的蛋白表達(dá)而改善阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。3 Liguzinediol通過(guò)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)抑制阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡3.1 Liguzinediol對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的受損的原代心肌細(xì)胞的外鈣內(nèi)流和內(nèi)鈣外排無(wú)影響鈣離子熒光檢測(cè)結(jié)果表明,與空白對(duì)照組比較,阿霉素組原代心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度顯著增加;與阿霉素組比較,給予Liguzinediol后原代心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度明顯降低。鈣成像結(jié)果表明,在有鈣緩沖液與無(wú)鈣緩沖液灌流的條件下,加入Liguzinediol均能夠引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子增加,說(shuō)明Liguzinediol對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子的調(diào)控與外鈣內(nèi)流無(wú)關(guān);阿霉素灌流后與灌流前比較,阿霉素能夠明顯增加細(xì)胞內(nèi)的鈣離子熒光強(qiáng)度;給予Liguzinediol后,與阿霉素組比較其鈣離子變化明顯降低,說(shuō)明Liguzinediol能夠降低阿霉素誘導(dǎo)的原代心肌細(xì)胞鈣離子增加。Western blot檢測(cè)心肌細(xì)胞膜上鈉鈣交換體(NCX)的表達(dá),實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與空白對(duì)照組比較,阿霉素能明顯增加細(xì)胞膜上NCX的表達(dá),Liguzinediol處理后,與阿霉素組比較,NCX的表達(dá)無(wú)明顯改變,說(shuō)明Liguzinediol不通過(guò)心肌細(xì)胞膜上的鈉鈣交換體來(lái)實(shí)現(xiàn)其對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子的調(diào)控,從而抑制心肌細(xì)胞的凋亡。3.2 Liguzinediol通過(guò)肌漿網(wǎng)內(nèi)鈣相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體調(diào)控阿霉素誘導(dǎo)受損H9C2細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失衡Western blot結(jié)果表明,與空白對(duì)照組比較,阿霉素組肌漿網(wǎng)鈣泵(SERCA2a)、蘭尼堿受體(RyR2)、肌漿網(wǎng)RyR2穩(wěn)定蛋白FKBP12.6以及三磷酸肌醇受體(IP3R2)的表達(dá)顯著降低,而p-RyR2的蛋白表達(dá)水平增加;給予Liguzinediol后,與阿霉素組比較SERCA2oα、RyR2、FKBP12.6以及IP3R2的蛋白表達(dá)水平增加,而p-RyR2的水平降低,說(shuō)明肌漿網(wǎng)內(nèi)SERCA2α等鈣相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體參與Liguzinediol對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的調(diào)控。3.3.Liguzinediol通過(guò)線粒體內(nèi)鈣相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體調(diào)控阿霉素誘導(dǎo)受損H9C2細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失衡Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn),與空白對(duì)照組比較,阿霉素組線粒體鈣單向轉(zhuǎn)運(yùn)體(MCU)、電壓依賴性陰離子通道(VDAC)以及線粒體自噬相關(guān)蛋白Fundcl表達(dá)增加;給予Liguzinediol后,與阿霉素組比較,其線粒體相關(guān)蛋白MCU、VDAC以及Fundcl表達(dá)明顯下降,說(shuō)明線粒體內(nèi)MCU等鈣相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體參與Liguzinediol對(duì)心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子的調(diào)控。另外,Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),與空白對(duì)照組比較,阿霉素組線粒體融合相關(guān)蛋白MFN1和MFN2蛋白表達(dá)減少,給予Liguzinediol后,與阿霉素組比較,MFN1和MFN2蛋白表達(dá)增加;與空白對(duì)照組比較,阿霉素組線粒體分裂相關(guān)蛋白(Fis1)和線粒體動(dòng)力相關(guān)蛋白(Drp1)的表達(dá)增加,給予Liguzinediol后,與阿霉素組比較,Fis1和Drp1的表達(dá)降低,說(shuō)明Liguzinediol對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的調(diào)控與線粒體的分裂和融合有關(guān)。3.4 Liguzinediol通過(guò)CaMKII以及PLC-IP3R2信號(hào)通路調(diào)節(jié)阿霉素誘的受損心肌細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失衡在心肌細(xì)胞內(nèi)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)鈣離子的相關(guān)通路有cAMP-PKA、CaM/CaMKII以及PLC-IP3R2。ELISA結(jié)果表明,與空白對(duì)照組比較,阿霉素組H9C2細(xì)胞cAMP的釋放顯著增加,給予Liguzinediol后,與阿霉素組比較,cAMP的含量沒(méi)有明顯影響。Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn),與空白對(duì)照組比較,阿霉素組蛋白激酶A(PKA)、鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(CaN)以及磷脂酶C(PLC)的表達(dá)明顯增加,給予Liguzinediol后,與阿霉素組比較Liguzinediol能夠明顯降低PLC蛋白的表達(dá)水平,而對(duì)PKA沒(méi)有明顯影響。說(shuō)明Liguzinediol對(duì)心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子的調(diào)控主要與Ca2+/CaMKII以及PLC-IP3R2信號(hào)通路有關(guān)。結(jié)論1 Liguzinediol減少阿霉素誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞損傷,通過(guò)抑制H9C2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)發(fā)揮其抗凋亡的作用。2 Liguzinediol作用于肌漿網(wǎng)和線粒體上鈣相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體調(diào)節(jié)阿霉素誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失衡,從而抑制H9C2細(xì)胞凋亡。3 Liguzinediol通過(guò)Ca2+/CaMKII以及PLC-IP3R2信號(hào)通路調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞內(nèi)的鈣穩(wěn)態(tài),抑制阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和增加心肌細(xì)胞的收縮力。
【學(xué)位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R541.6
【圖文】：

與空白對(duì)照組比較，阿霉素組Ｈ９Ｃ２細(xì)胞活力明顯降低，差異具有顯著性（ｐ＜０．０１）；逡逑給予不同濃度的Ｌｉｇｕｚｉｎｅｄｉｏｌ后，與模型組比較Ｈ９Ｃ２細(xì)胞活力明顯增加，且在濃度為逡逑ｌ（ｙ４ｍｏｌ／Ｌ時(shí)對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的Ｈ９Ｃ２細(xì)胞損傷的抑制作用最強(qiáng)（ｐ＜０．０１邋），實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖１－１。逡逑因此，選擇１０＇邋１０＇邋ｌｔ＾ｍｏｌ／Ｌ作為高、中、低劑量組用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。逡逑０．５－１逡逑ｉｉｌＬｉ逡逑＾邋ｌＯＭＯＭＯ－４邋１０－５１０６１０邋７邋１0－８逡逑＊６邋＾邐逡逑＾邋Ｌｉｇｕｚｉｎｅｄｉｏｌ邋（ｍｏｌ／Ｌ）逡逑圖１－１邋Ｌｉｇｕｚｉｎｅｄｉｏｌ對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的Ｈ９Ｃ２細(xì)胞的影響逡逑（ｎ＝６，注：與模型組比較，＊尸＜０．０５，邋＊＊尸＜０．０１，邋＊＊＊Ｐ＜０．０１，下同）逡逑４．邐Ｌｉｇｕｚｉｎｅｄｉｏｌ增強(qiáng)阿霉誘導(dǎo)受損Ｈ９Ｃ２細(xì)胞的收縮功能逡逑通過(guò)膠原收縮實(shí)驗(yàn)觀察Ｌｉｇｕｚｉｎｅｄｉｏｌ對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的受損Ｈ９Ｃ２細(xì)胞收縮功能的影響。逡逑與空白對(duì)照組比較，阿霉素組Ｈ９Ｃ２細(xì)胞收縮功能明顯降低，膠原面積增加收縮減少；與逡逑阿霉素組比較，Ｌｉｇｕｚｉｎｅｄｉｏｌ能夠明顯減輕阿霉素誘導(dǎo)的Ｈ９Ｃ２細(xì)胞收縮功能的損傷，膠原逡逑收縮面積增加，結(jié)果見(jiàn)圖１－２。說(shuō)明Ｌｉｇｕｚｉｎｅｄｉｏｌ可以增強(qiáng)阿霉素誘導(dǎo)的受損Ｈ９Ｃ２細(xì)胞的逡逑收縮功能。逡逑６逡逑

與空白對(duì)照組比較，阿霉素組Ｈ９Ｃ２細(xì)胞活力明顯降低，差異具有顯著性（ｐ＜０．０１）；逡逑給予不同濃度的Ｌｉｇｕｚｉｎｅｄｉｏｌ后，與模型組比較Ｈ９Ｃ２細(xì)胞活力明顯增加，且在濃度為逡逑ｌ（ｙ４ｍｏｌ／Ｌ時(shí)對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的Ｈ９Ｃ２細(xì)胞損傷的抑制作用最強(qiáng)（ｐ＜０．０１邋），實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖１－１。逡逑因此，選擇１０＇邋１０＇邋ｌｔ＾ｍｏｌ／Ｌ作為高、中、低劑量組用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。逡逑０．５－１逡逑ｉｉｌＬｉ逡逑＾邋ｌＯＭＯＭＯ－４邋１０－５１０６１０邋７邋１0－８逡逑＊６邋＾邐逡逑＾邋Ｌｉｇｕｚｉｎｅｄｉｏｌ邋（ｍｏｌ／Ｌ）逡逑圖１－１邋Ｌｉｇｕｚｉｎｅｄｉｏｌ對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的Ｈ９Ｃ２細(xì)胞的影響逡逑（ｎ＝６，注：與模型組比較，＊尸＜０．０５，邋＊＊尸＜０．０１，邋＊＊＊Ｐ＜０．０１，下同）逡逑４．邐Ｌｉｇｕｚｉｎｅｄｉｏｌ增強(qiáng)阿霉誘導(dǎo)受損Ｈ９Ｃ２細(xì)胞的收縮功能逡逑通過(guò)膠原收縮實(shí)驗(yàn)觀察Ｌｉｇｕｚｉｎｅｄｉｏｌ對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的受損Ｈ９Ｃ２細(xì)胞收縮功能的影響。逡逑與空白對(duì)照組比較，阿霉素組Ｈ９Ｃ２細(xì)胞收縮功能明顯降低，膠原面積增加收縮減少；與逡逑阿霉素組比較，Ｌｉｇｕｚｉｎｅｄｉｏｌ能夠明顯減輕阿霉素誘導(dǎo)的Ｈ９Ｃ２細(xì)胞收縮功能的損傷，膠原逡逑收縮面積增加，結(jié)果見(jiàn)圖１－２。說(shuō)明Ｌｉｇｕｚｉｎｅｄｉｏｌ可以增強(qiáng)阿霉素誘導(dǎo)的受損Ｈ９Ｃ２細(xì)胞的逡逑收縮功能。逡逑６逡逑

ｂｃｌ－２的蛋白表達(dá)使Ｂａｘ／Ｂｃｌ－２的比例增加（ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１）；邋ＣｙｔＣ在阿霉素作用于心肌細(xì)逡逑胞２４ｈ后，與空白對(duì)照組比較，其蛋白表達(dá)明顯增加（ｐ＜０．０１）；給予Ｌｉｇｕｚｉｎｅｄｉｏｌ后，與逡逑阿霉素組比較Ｌｉｇｕｚｉｎｅｄｉｏｌ能夠顯著降低細(xì)胞色素Ｃ的釋放，結(jié)果見(jiàn)圖２－２。逡逑Ｉ１５］邐｜邋１＇５］邐□邋Ｐｒｏ－ｃａＳｐａＳＣ３逡逑Ｐｒｏ－ｃａｓｐａｓｅ３邐ｍｍ邋ｍｍ邐１１０．邐＾邐ｇ邋１邋°＇邐Ａ邋Ｔ逡逑ｇ邋．邋＿邋Ｔ邋．邋！邐■邐■邋ＪＬ逡逑ｄｅａ、ｅｄ，ａｓｅ３邋—邐｜。５邋‘囊邋＿邐■邋！。５．邋■逡逑Ｍｃ＜ｉ0邐Ｉ邋｜邐｜邋ｊ．．邋｜逡逑ｉ邋ｏ．ｏ＾—ｒ——0．0■＊—ｉ—逡逑多々邋１０－＊邋１0－？邋１０邋七邐＾邋、邋１（Ｈ邋１０＾邋１０＾邐＾邐、邋ｌ0４邋１０－５邋ｌ0４逡逑＇、邐Ｌｉｇｕｚｉｎｅｄｉｏｌ邐Ｃ０＜ｋ邋＾邋Ｌｉｇｕｚｉｎｃｄｉｏｌ（ｍｏｌ／Ｌ）邋ｃ0＾邐Ｌｉｇｕｚｉｎｅｄｉｏｌ（ｍｏｌ／Ｌ）逡逑ｂａｘ邐一夬＿？邋一邋＿邐Ｅ邐Ａ逡逑Ｐ邋＊｜２逡逑0．ｓ－逡逑NB、？ＨＨ邋ｌｆｒｓ邋１（Ｈ邐允邐１０－＊邐１０＞邐１０＾逡逑９邐＾邋00＊＊邋邐逡逑Ｃ．邐Ｌｉｇｕｚｉｎｅｄｉｏｌ邐Ｌｉｇｕｚｉｎｅｄｉｏｌ（邋ｍｏｌ／Ｌ）逡逑�。保担姟蹂澹眩椋沐义希藻义希纾保埃鍔皱义希茫簦缅澹濉澹姟姡赍濉垮澹村义希�0５－邋？？？邋ＷＢ邋ｈＣ｜逡逑Ｍ＾＞ｎ邐ＭＢ逡逑ｇｃＪｌｉ二U

本文編號(hào)：2746072