發(fā)布時間：2020-06-14 00:34

【摘要】：先天性心臟病(Congenital heart disease,CHD)是胚胎發(fā)育過程中心臟和血管結構性異常引起的一類心血管疾病,也是我國排名首位的出生缺陷類型。先天性心臟病的發(fā)生和發(fā)展是遺傳和環(huán)境共同作用的結果。GDF1在胚胎左右軸不對稱的建立及心臟環(huán)化中發(fā)揮重要作用,GDF1突變與CHD的發(fā)生密切相關,但對GDF1轉錄調(diào)控機制研究罕見報道。GDF1由一個保守的雙順反子mRNA編碼,該mRNA含有GDF1和Cers1兩個編碼區(qū),其中Cers1位于GDF1上游。我們實驗室前期已經(jīng)證實Cers1翻譯起始位點ATG(+1)上下游-608/+71區(qū)域包含GDF1啟動子序列。使用轉錄因子結合軟件PROMO和JASPAR進行生物信息學分析,我們發(fā)現(xiàn)GDF1啟動子序列含有三個潛在的NKE位點,NKE位點是NK類同源域蛋白在DNA上的結合元件。Nkx2.5作為肌源性譜系發(fā)育所必需的NK類同源異型結構域蛋白NK-2成員之一,在心臟發(fā)育中具有重要作用,其突變可導致多種CHD表型,因此我們推測轉錄因子Nkx2.5可能調(diào)控GDF1的表達,并進一步通過實驗進行了鑒定。我們利用pcDNA3.1-myc-His空載體和pcDNA3.1-myc-Nkx2.5表達質(zhì)粒與pGL3-GDF1啟動子報告質(zhì)粒共轉染HEK293ET細胞,雙熒光報告基因?qū)嶒灆z測GDF1啟動子活性,發(fā)現(xiàn)Nkx2.5過表達激活了 GDF1啟動子的活性。用pcDNA3.1-myc-His空載體和pcDNA3.1-myc-Nkx2.5表達質(zhì)粒分別轉染HEK293ET細胞24h后,Real-time PCR結果顯示Nkx2.5過表達顯著升高GDF1 mRNA的水平,Western Blot結果顯示Nkx2.5過表達顯著增加GDF1蛋白水平。利用對照重組腺病毒和重組腺病毒Ad-Nkx2.5分別感染H9c2心肌細胞24h后,Western Blot結果顯示Nkx2.5過表達顯著上調(diào)GDF1蛋白水平。斑馬魚Dvr1基因是哺乳動物GDF1的同源基因。我們以脊椎動物模式生物斑馬魚為模型,利用morpholino技術敲低Nkx2.5基因,整胚原位雜交和Real-time PCR結果均顯示Nkx2.5敲低顯著降低了斑馬魚胚胎Dvr1的轉錄水平,而Nkx2.5過表達則逆轉斑馬魚Dvr1轉錄水平的下調(diào)。這些結果表明Nkx2.5能轉錄激活GDF1的表達。我們進一步鑒定Nkx2.5在GDF1啟動子區(qū)結合位點。生物信息學分析發(fā)現(xiàn)三個潛在NKE位點分別位于GDF1啟動子區(qū)域-517、-440和-203位置。我們以野生型GDF1啟動子區(qū)域-608/+71為骨架分別構建了針對-517、-440和-203位置的三個突變報告質(zhì)粒,將野生型和突變型報告質(zhì)粒分別轉染HEK293ET和H9c2細胞,雙熒光報告基因活性檢測表明在兩種細胞中-517結合位點的突變都顯著抑制GDF1啟動子活性,而-440或-203位點突變的抑制作用較弱或無明顯作用。因此,我們側重研究了-517位點在Nkx2.5調(diào)控GDF1中的作用。利用pcDNA3.1-myc-NKX2.5轉染HEK293ET細胞后提取核蛋白,分別與復性生物素標記的-517位點野生型和突變型的雙鏈寡核苷酸探針進行DNA pulldown分析。結果表明,突變的-517結合位點與Nkx2.5蛋白的結合能力較野生型-517結合能力顯著下降。隨后利用野生型GDF1啟動子報告質(zhì)粒和-517結合位點突變的報告質(zhì)粒以及不同濃度的pcDNA3.1-myc-Nkx2.5表達質(zhì)粒共轉染HEK293ET和H9c2細胞。雙熒光報告基因檢測結果表明,在兩種細胞中Nkx2.5過表達均導致野生型GDF1啟動子活性呈劑量依賴性顯著增加,而-517結合位點突變后,Nkx2.5的激活效應均降低約70%并且不受劑量梯度影響。利用pcDNA3.1-myc-Nkx2.5轉染HEK293ET細胞后,利用Myc抗體進行染色質(zhì)免疫沉淀實驗,Real-time PCR檢測結果表明與對照血清相比,以Myc抗體免疫沉淀物為模板能顯著擴增含有-517位點的啟動子區(qū)域,表明Nkx2.5在體內(nèi)能與GDF1啟動子結合。綜上所述,我們發(fā)現(xiàn)Nkx2.5過表達激活GDF1啟動子的活性并上調(diào)GDF1的表達。Nkx2.5敲低顯著降低了哺乳動物GDF1在斑馬魚中的同源基因Dvr1的轉錄水平,而Nkx2.5過表達則逆轉這種效應。進一步的機制研究發(fā)現(xiàn)Nkx2.5能通過-517位點調(diào)控GDF1的表達。以上研究結果表明GDF1是Nkx2.5的一個新穎靶基因。此外,我們實驗室前期用miRNA芯片技術對卵泡刺激素(FSH)刺激孕酮合成前后的大鼠原代培養(yǎng)顆粒細胞進行分析,發(fā)現(xiàn)31個表達差異的miRNA,其中miR-132是受FSH調(diào)控變化幅度差異最顯著的基因之一。我們隨后對miR-132在FSH介導的顆粒細胞合成孕酮中的作用進行了初步探究。用50ng/ml FSH處理原代顆粒細胞后進行Real-time PCR檢測,發(fā)現(xiàn)FSH處理不同時間點,miR-132的表達水平顯著上調(diào)。利用對照重組腺病毒和重組腺病毒Ad-miR132感染原代顆粒細胞,Real-time PCR檢測結果表明感染Ad-miR132后miR-132表達水平顯著增加。利用對照重組腺病毒和Ad-miR132感染原代顆粒細胞后再經(jīng)FSH處理,放射免疫法檢測結果表明,感染Ad-miR132后顯著增加了 FSH介導的顆粒細胞孕酮合成。文獻報道Foxo3a在卵泡發(fā)育中發(fā)揮重要作用,已知Foxo3a是miR-132的下游靶基因。我們用Western Blot檢測FSH處理顆粒細胞Foxo3a的表達,結果顯示FSH處理不同時間點,Foxo3a表達呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢,提示miR-132可能在顆粒細胞中負調(diào)控Foxo3a的表達。以上研究結果表明miR-132對FSH介導的顆粒細胞孕酮合成有促進作用。 【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R541.1

【圖文】：

其中ｐＲＬ－ＴＫ為內(nèi)參。結果顯示，，與共轉染空載體和ｐＧＬ３－ＧＤＦｌ啟逡逑動子報告質(zhì)粒對照組相比，Ｎｋｘ２．５過表達導致ＧＤＦ１啟動子活性顯著增加約３逡逑倍（圖１－１），提示Ｎｋｘ２．５能夠激活ＧＤＦ１的啟動子活性。逡逑６．０－１逡逑Ｉ－邋｜｜逡逑ｍ逡逑｜邋２．０－逡逑％．0１0Ｊ（Ｌ逡逑Ｖｅｃｔｏｒ邋ＮＫｘ２．５逡逑圖１－１邋Ｎｋｘ２．５對ＧＤＦ１啟動子活性的影響。ｐＧＬ３－ＧＤＦｌ啟動子報告質(zhì)粒與逡逑ｐｃＤＮＡ３．１－ｍｙｃ－Ｈｉｓ邋空載體或邋ｐｃＤＮＡ３．１－ｍｙｃ－Ｎｋｘ２．５邋表達質(zhì)粒共轉染邋ＨＥＫ２９３ＥＴ邋細胞邋２４ｈ邋后，逡逑進行雙熒光素酶活性檢測。以ｐＲＬ－ＴＫ邋（螢火蟲熒光素酶活性）作為內(nèi)參。星號表示與對照逡逑３４逡逑

逡逑圖１４邋Ｎｋｘ２．５對ＧＤＦ１蛋白水平的影響。（Ａ）邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ檢測重組腺病毒Ａｄ－Ｃｔｒｌ和逡逑Ａｄ－Ｎｋｘ２．５分別感染Ｈ９ｃ２細胞２４ｈ后Ｎｋｘ２．５、ＧＤＦ１的蛋白表達水平；（Ｂ）邋ＧＤＦ１與內(nèi)參逡逑ｐ－ａｃｔｉｎ蛋白比值的灰度分析柱狀圖，星號表示與對照組相比的統(tǒng)計學顯著性差異…Ｐ＜０．００１；逡逑數(shù)值以均數(shù)：ｔＳ．Ｅ．三次獨立重復實驗中的一次結果。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－４邋Ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋Ｎｋｘ２．５邋ｏｎ邋ＧＤＦ１邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｌｅｖｅｌ．邋（Ａ）邋Ｔｈｅ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｌｅｖｅｌｓ邋ｏｆ邋Ｎｋｘ２．５逡逑ａｎｄ邋ＧＤＦ１邋ａｆｔｅｒ邋ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ邋ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ邋Ａｄ－ｃｔｒｌ邋ａｎｄ邋Ａｄ－ｎｋｘ２．５邋ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ邋ｗｉｔｈ邋Ｈ９ｃ２邋ｃｅｌｌｓ邋ｆｏｒ邋２４ｈ．逡逑（Ｂ）邋Ｔｈｅ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｒａｔｉｏ邋ｏｆ邋ＧＤＦ１邋ｔｏ邋Ｐ－ａｃｔｉｎ邋，＊＊＊Ｐ＜０．００１邋ｖｓ邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋ｇｒｏｕｐ；邋Ｄａｔａ邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ邋ｔｈｅ逡逑ｍｅａｎ士邋Ｓ．Ｅ．邋Ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｏｆ邋ｏｎｅ邋ｏｆ邋ｔｈｒｅｅ邋ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ邋ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ．逡逑１．５邋Ｎｋｘ２．５上調(diào)斑馬魚胚胎中Ｄｖｒｌ的表達逡逑斑馬魚作為脊椎動物模式生物和人類基因有著近８７％的高度同源性，其心血逡逑管系統(tǒng)的早期發(fā)育與人類極為相似［６２］，是一種研究心臟發(fā)育的良好模型。斑馬逡逑魚Ｄｖｒｌ是哺乳動物ＧＤＦ１和非洲爪蟾Ｖｇｌ的同源基因

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本文編號：2711986