【摘要】：目的:研究同型半胱氨酸(HCY)誘導miR-33是否通過氧化物酶增殖物激活受體α(PPARα)-肝臟X核受體α(LXRα)途徑抑制膽固醇逆轉(zhuǎn)運(RCT),促進脂質(zhì)聚集,導致動脈粥樣硬化(AS)。方法:實驗一:(1)RAW264.7巨噬細胞經(jīng)氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)誘導成為泡沫細胞,油紅“O”染色鑒定泡沫細胞是否誘導成功。(2)再給予不同濃度梯度(空白對照組、0.5 mmol/L、1.0 mmol/L、2.0 mmol/L、5.0 mmol/L)同型半胱氨酸(HCY)干預。(3)油紅“O”染色觀察細胞內(nèi)脂滴情況。(4)蛋白免疫印跡(Western blot)和實時定量聚合酶鏈式反應(RT-qPCR)檢測三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體A1(ABCA1)、三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體G1(ABCG1)及過氧化物酶增殖物激活受體α(PPARα)、肝臟X核受體α(LXRα)的蛋白和mRNA表達水平。(5)高效液態(tài)相譜檢測胞內(nèi)膽固醇酯含量。(6)液體閃爍計數(shù)法分析胞內(nèi)膽固醇流出率。實驗二:(1)RAW264.7巨噬細胞經(jīng)氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)誘導成為泡沫細胞模型,油紅“O”染色確定模型是否誘導成功。(2)用lipofectamin 2000?將miR-33 mimics、miR-33 inhibitor轉(zhuǎn)染入細胞內(nèi),再選取實驗一抑制膽固醇逆轉(zhuǎn)運最佳HCY濃度(5.0 mmol/L)干預24 h進行實驗。(3)油紅“O”染色觀察細胞內(nèi)脂滴情況。(4)蛋白免疫印跡(Western blot)和實時定量聚合酶鏈式反應(RT-qPCR)檢測三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體A1(ABCA1)、三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體G1(ABCG1)及過氧化物酶增殖物激活受體α(PPARα)、肝臟X核受體α(LXRα)蛋白和mRNA表達水平。(5)實時定量聚合酶鏈式反應(RT-qPCR)檢測miR-33 mRNA表達含量。(6)高效液態(tài)相譜檢測胞內(nèi)膽固醇酯含量。(7)液體閃爍計數(shù)法分析胞內(nèi)膽固醇流出率。結(jié)果:結(jié)果一:(1)與空白對照組相比較,HCY干預組ABCA1、ABCG1及PPARα、LXRα的蛋白和mRNA的表達量均降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05);細胞內(nèi)的膽固醇含量均增高,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05);細胞內(nèi)膽固醇流出率降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。(2)隨HCY濃度增加,組間相比較,結(jié)果是濃度越高,ABCA1、ABCG1及PPARα、LXRα的蛋白和mRNA表達量越低,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05);細胞內(nèi)的膽固醇含量越高,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05);細胞內(nèi)膽固醇流出率越低,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結(jié)果二:(1)隨HCY濃度增加,組間相比較,結(jié)果是濃度越高,miR-33 mRNA表達含量越高,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。(2)與對照組相比,miR-33 mimics組ABCA1、ABCG1及PPARα、LXRα蛋白和mRNA的表達量均降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05);細胞內(nèi)膽固醇含量逐漸增加,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05);細胞內(nèi)膽固醇流出率逐漸減少,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。(3)與對照組相比,miR-33 inhibitor組ABCA1、ABCG1及PPARα、LXRα蛋白和mRNA的表達量均升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05);細胞內(nèi)膽固醇含量逐漸降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05);細胞內(nèi)膽固醇流出率逐漸增加,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。(4)空白對照組、miR-33 mimics NC組和miR-33 inhibitor NC組3組間相比較,所有檢測指標均無統(tǒng)計學差異(P0.05)。結(jié)論:1.同型半胱氨酸(HCY)通過抑制ABCA1和ABCG1蛋白及mRNA表達,降低膽固醇逆轉(zhuǎn)運(RCT)效率,促進脂質(zhì)聚集,導致動脈粥樣硬化(AS)。2.同型半胱氨酸(HCY)通過抑制PPARα-LXRα通路下調(diào)ABCA1和ABCG1蛋白及mRNA表達,降低膽固醇逆轉(zhuǎn)運(RCT)效率,促進脂質(zhì)聚集。3.同型半胱氨酸(HCY)可以誘導miR-33含量增加,提示兩者具有相關性。4.同型半胱氨酸(HCY)通過誘導miR-33抑制ABCA1和ABCG1蛋白及mRNA表達,降低膽固醇逆轉(zhuǎn)運(RCT)效率,促進脂質(zhì)聚集,導致動脈粥樣硬化(AS)。5.同型半胱氨酸(HCY)通過誘導miR-33抑制PPARα-LXRα途徑下調(diào)ABCA1和ABCG1蛋白及mRNA表達,降低膽固醇逆轉(zhuǎn)運(RCT)效率,促進脂質(zhì)聚集,導致動脈粥樣硬化(AS)。
【圖文】：

油紅“O”染色觀察細胞內(nèi)脂滴含量（X20）

Westernblot與RT-qPCR檢測PPARα和LXRα蛋白及mRNA表達
【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R543.5

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1 代佩;同型半胱氨酸誘導miR-33經(jīng)PPARα-LXRα途徑抑制膽固醇逆轉(zhuǎn)運的機制研究[D];山西醫(yī)科大學;2019年

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本文編號：2625100